secuenciación del exoma

Los métodos de enriquecimiento de dianas permiten capturar selectivamente regiones genómicas de interés a partir de una muestra de ADN antes de la secuenciación. Se han desarrollado varias estrategias de enriquecimiento de dianas desde la descripción original del método de selección genómica directa (DGS) en 2005. ^{[ 8 ]}

Aunque se han descrito muchas técnicas para la captura dirigida, solo unas pocas se han extendido para capturar exomas completos. ^{[ 9 ]} La primera estrategia de enriquecimiento de objetivos que se aplicó a la secuenciación de exomas completos fue el método de captura híbrida basado en matrices en 2007, pero la captura en solución ha ganado popularidad en los últimos años.

Captura basada en matrices

Los microarrays contienen oligonucleótidos monocatenarios con secuencias del genoma humano que cubren la región de interés fijada a la superficie. El ADN genómico se fragmenta para formar fragmentos bicatenarios. Estos fragmentos se reparan en sus extremos para producir extremos romos y se les añaden adaptadores con secuencias de cebado universales. Dichos fragmentos se hibridan con los oligonucleótidos del microarray. Los fragmentos no hibridados se eliminan mediante lavado y se eluyen los fragmentos deseados. Posteriormente, los fragmentos se amplifican mediante PCR . ^{[ 10 ] [ 11 ]}

Roche NimbleGen fue la primera en tomar la tecnología DGS original ^{[ 8 ]} y adaptarla para la secuenciación de próxima generación. Desarrollaron el Sequence Capture Human Exome 2.1M Array para capturar aproximadamente 180 000 exones codificantes. ^{[ 12 ]} Este método ahorra tiempo y es rentable en comparación con los métodos basados ​​en PCR. El Agilent Capture Array y el array de hibridación genómica comparativa son otros métodos que se pueden utilizar para la captura híbrida de secuencias objetivo. Las limitaciones de esta técnica incluyen la necesidad de hardware costoso, así como una cantidad relativamente grande de ADN. ^{[ 13 ]}

Existen numerosas plataformas de secuenciación de nueva generación (NGS) posteriores a las metodologías clásicas de secuenciación de Sanger. Otras plataformas incluyen el secuenciador Roche 454 y los sistemas SOLiD de Life Technologies , el Ion Torrent de Life Technologies y el Illumina Genome Analyzer II (ya descatalogado) de Illumina, así como los instrumentos posteriores de las series MiSeq, HiSeq y NovaSeq de Illumina, todos los cuales pueden utilizarse para la secuenciación masiva en paralelo del exoma. Estos sistemas NGS de "lectura corta" son especialmente adecuados para analizar numerosos fragmentos relativamente cortos de secuencia de ADN, como los que se encuentran en los exones humanos.

Los microarrays utilizan sondas de hibridación para evaluar la prevalencia de secuencias de ADN conocidas, por lo que no pueden utilizarse para identificar cambios genéticos inesperados. ^{[ 13 ]} En cambio, las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento utilizadas en la secuenciación del exoma proporcionan directamente las secuencias de nucleótidos del ADN en los miles de loci exónicos analizados. ^{[ 15 ]} Por lo tanto, la secuenciación del exoma completo (WES) aborda algunas de las limitaciones actuales de los microarrays de genotipado por hibridación .

Si bien la secuenciación del exoma es más costosa por muestra que las tecnologías basadas en hibridación, su costo ha ido disminuyendo debido a la bajada de costos y al aumento del rendimiento de la secuenciación del genoma completo .

La secuenciación del exoma solo puede identificar las variantes que se encuentran en la región codificante de los genes que afectan la función de las proteínas. No puede identificar las variantes estructurales y no codificantes asociadas con la enfermedad, que se pueden encontrar utilizando otros métodos como la secuenciación del genoma completo . ^{[ 2 ]} Aún queda el 99 % del genoma humano que no se cubre con la secuenciación del exoma, y ​​esta permite secuenciar porciones del genoma en al menos 20 veces más muestras en comparación con la secuenciación del genoma completo. ^{[ 2 ]} Para la traslación de variantes raras identificadas a la clínica, el tamaño de la muestra y la capacidad de interpretar los resultados para proporcionar un diagnóstico clínico indican que, con el conocimiento actual en genética, existen informes de uso de la secuenciación del exoma para ayudar al diagnóstico. ^{[ 12 ]} El costo de la secuenciación del exoma suele ser menor que el de la secuenciación del genoma completo. ^{[ 16 ]}

Los estudios de asociación actuales se han centrado en la variación común en todo el genoma, ya que son las más fáciles de identificar con nuestros ensayos actuales. Sin embargo, se ha descubierto que variantes causantes de enfermedades con un gran efecto se encuentran dentro de los exomas en estudios de genes candidatos y, debido a la selección negativa , se encuentran en frecuencias alélicas mucho más bajas y pueden permanecer sin tipificar en los ensayos de genotipado estándar actuales. La secuenciación del genoma completo es un método potencial para analizar variantes nuevas en todo el genoma. Sin embargo, en trastornos complejos (como el autismo ), se cree que un gran número de genes están asociados con el riesgo de enfermedad. ^{[ 1 ] [ 22 ]} Esta heterogeneidad del riesgo subyacente significa que se requieren tamaños de muestra muy grandes para el descubrimiento de genes y, por lo tanto, la secuenciación del genoma completo no es particularmente rentable. Este problema del tamaño de la muestra se alivia con el desarrollo de nuevos métodos analíticos avanzados, que mapean eficazmente los genes de la enfermedad a pesar de que las mutaciones genéticas son raras a nivel de variante. ^{[ 22 ]} Además, las variantes en las regiones codificantes se han estudiado mucho más extensamente y sus implicaciones funcionales son mucho más fáciles de derivar, lo que hace que las aplicaciones prácticas de las variantes dentro de la región del exoma objetivo sean más accesibles de inmediato.

La secuenciación del exoma para el descubrimiento de variantes genéticas raras sigue siendo un área de investigación muy activa y en constante desarrollo, y existe evidencia creciente de que se observa una carga de riesgo significativa en conjuntos de genes. Se han reportado variantes raras en el gen KRT82 en el trastorno autoinmune alopecia areata mediante secuenciación del exoma . ^{[ 1 ]}

En los trastornos mendelianos de gran efecto, los hallazgos hasta el momento sugieren que una o un número muy reducido de variantes dentro de los genes codificantes subyacen a la enfermedad en su totalidad. Debido a la gravedad de estos trastornos, se presume que las pocas variantes causales son extremadamente raras o novedosas en la población, y pasarían desapercibidas en cualquier ensayo de genotipado estándar . La secuenciación del exoma proporciona una alta cobertura de variantes en las regiones codificantes, lo cual es necesario para separar las variantes verdaderas del ruido. Un modelo exitoso de descubrimiento de genes mendelianos implica el descubrimiento de variantes de novo mediante la secuenciación de tríos, donde se genotipifica a los padres y al probando.

La secuenciación del exoma puede utilizarse para diagnosticar la causa genética de una enfermedad en un paciente. La identificación de la(s) mutación(es) del gen subyacente puede tener importantes implicaciones para los enfoques diagnósticos y terapéuticos, puede guiar la predicción de la historia natural de la enfermedad y permite realizar pruebas a los miembros de la familia en riesgo. ^{[ 2 ] [ 3 ] [ 12 ] [ 23 ] [ 24 ] [ 25 ]} Existen muchos factores que hacen que la secuenciación del exoma sea superior al análisis de un solo gen, incluyendo la capacidad de identificar mutaciones en genes que no se analizaron debido a una presentación clínica atípica ^{[ 25 ]} o la capacidad de identificar casos clínicos donde mutaciones de diferentes genes contribuyen a los diferentes fenotipos en el mismo paciente. ^{[ 3 ]}

Tras diagnosticar una causa genética de una enfermedad, esta información puede orientar la selección del tratamiento adecuado. La primera vez que esta estrategia se aplicó con éxito en la clínica fue en el tratamiento de un lactante con enfermedad inflamatoria intestinal . ^{[ 24 ] [ 26 ]} Se habían utilizado previamente varios métodos de diagnóstico convencionales, pero los resultados no pudieron explicar los síntomas del lactante. El análisis de los datos de secuenciación del exoma identificó una mutación en el gen XIAP . El conocimiento de la función de este gen guió el tratamiento del lactante, lo que condujo a un trasplante de médula ósea que curó al niño de la enfermedad. ^{[ 24 ]}

Investigadores han utilizado la secuenciación del exoma para identificar la mutación subyacente en un paciente con síndrome de Bartter y diarrea congénita por cloruro . ^{[ 12 ]} El grupo de Bilgular también utilizó la secuenciación del exoma e identificó la mutación subyacente en un paciente con malformaciones cerebrales graves, afirmando: "[Estos hallazgos] resaltan el uso de la secuenciación del exoma completo para identificar loci de enfermedades en entornos donde los métodos tradicionales han resultado desafiantes... Nuestros resultados demuestran que esta tecnología será particularmente valiosa para el descubrimiento de genes en aquellas afecciones donde el mapeo se ha visto dificultado por la heterogeneidad del locus y la incertidumbre sobre los límites de la clasificación diagnóstica, lo que apunta a un futuro brillante para su amplia aplicación en medicina". ^{[ 23 ]}

Investigadores de la Universidad de Ciudad del Cabo , Sudáfrica, utilizaron la secuenciación del exoma para descubrir la mutación genética del gen CDH2 como la causa subyacente de un trastorno genético conocido como miocardiopatía arritmogénica del ventrículo derecho (ARVC), que aumenta el riesgo de enfermedad cardíaca y paro cardíaco.

Varias empresas han ofrecido secuenciación de exoma a consumidores. Knome fue la primera en ofrecer servicios de secuenciación de exoma a consumidores , a un costo de varios miles de dólares. ^{[ 27 ]} Posteriormente, 23andMe llevó a cabo un programa piloto de WES que se anunció en septiembre de 2011 y se suspendió en 2012. Los consumidores podían obtener datos de exoma a un costo de $999. La empresa proporcionaba datos brutos y no ofrecía análisis. ^{[ 27 ] [ 28 ] [ 29 ]}

En noviembre de 2012, DNADTC, una división de Gene by Gene, comenzó a ofrecer exomas con una cobertura de 80X y un precio introductorio de $695. ^{[ 30 ]} Este precio, según el sitio web de DNADTC, es actualmente de $895. En octubre de 2013, BGI anunció una promoción para la secuenciación personal de exoma completo con una cobertura de 50X por $499. ^{[ 31 ]} En junio de 2016, Genos logró un precio aún más bajo de $399 con un exoma de consumidor con certificación CLIA de 75X secuenciado a partir de saliva. ^{[ 32 ] [ 33 ] [ 34 ]}

Una revisión de 36 estudios realizada en 2018 encontró que el costo de la secuenciación del exoma oscilaba entre 555  USD y 5169  USD, con un rendimiento diagnóstico que variaba entre el 3 % y el 79 % dependiendo de los grupos de pacientes. ^{[ 16 ]}