RecBCD

La exodesoxirribonucleasa V (EC 3.1.11.5, RecBCD, exonucleasa V, exonucleasa V de Escherichia coli , exonucleasa V de E. coli , endoenzima del gen recBC, desoxirribonucleasa RecBC, DNasa del gen recBC, enzimas del gen recBCD ) es una enzima de E. coli que inicia la reparación recombinacional de roturas de doble cadena potencialmente letales en el ADN que pueden resultar de radiación ionizante , errores de replicación, endonucleasas , daño oxidativo y una multitud de otros factores. ^{[ 2 ] [ 3 ]} La enzima RecBCD es tanto una helicasa que desenrolla o separa las cadenas de ADN, como una nucleasa que hace muescas de cadena simple en el ADN. ^{[ 1 ]} Cataliza la escisión exonucleolítica (en presencia de ATP) en dirección 5′- a 3′- o 3′- a 5′- para producir 5′-fosfooligonucleótidos.

El complejo enzimático está compuesto por tres subunidades diferentes llamadas RecB, RecC y RecD, por lo que el complejo se denomina RecBCD (Figura 1). Antes del descubrimiento del gen recD , ^{[ 4 ]} la enzima se conocía como “RecBC”. Cada subunidad está codificada por un gen independiente:

Tanto la subunidad RecD como la RecB son helicasas, es decir , motores moleculares dependientes de energía que desenrollan el ADN (o el ARN en el caso de otras proteínas). La subunidad RecB, además, tiene una función nucleasa. ^{[ 5 ]} Finalmente, la enzima RecBCD (quizás la subunidad RecC) reconoce una secuencia específica en el ADN, 5' -GCTGGTGG- 3' , conocida como Chi (a veces designada con la letra griega χ).

RecBCD es inusual entre las helicasas porque tiene dos helicasas que viajan a diferentes velocidades ^{[ 6 ]} y porque puede reconocer y ser alterada por la secuencia de ADN Chi. ^{[ 7 ] [ 8 ]} RecBCD se une ávidamente a un extremo de ADN bicatenario lineal (ds). La helicasa RecD viaja en la hebra con un extremo 5' en el que la enzima inicia el desenrollamiento, y RecB en la hebra con un extremo 3'. RecB es más lenta que RecD, de modo que un bucle de ADN monocatenario (ss) se acumula delante de RecB (Figura 2). Esto produce estructuras de ADN con dos colas ss (una cola más corta con extremo 3' y una cola más larga con extremo 5') y un bucle ss (en la hebra con extremo 3') observado por microscopía electrónica. ^{[ 9 ]} Las colas ss pueden hibridar para producir un segundo bucle ss complementario al primero; Estas estructuras de doble bucle se conocían inicialmente como "orejas de conejo".

Durante el desenrollamiento, la nucleasa en RecB puede actuar de diferentes maneras dependiendo de las condiciones de reacción, en particular la relación de las concentraciones de iones Mg ²⁺ y ATP. (1) Si el ATP está en exceso, la enzima simplemente corta la hebra con Chi (la hebra con el extremo 3' inicial) (Figura 2). ^{[ 10 ] [ 11 ]} El desenrollamiento continúa y produce una cola 3' ss con Chi cerca de su extremo. Esta cola puede ser unida por la proteína RecA, que promueve el intercambio de hebras con un dúplex de ADN homólogo intacto. ^{[ 12 ]} Cuando RecBCD llega al final del ADN, las tres subunidades se desensamblan y la enzima permanece inactiva durante una hora o más; ^{[ 13 ]} una molécula de RecBCD que actuó en Chi no ataca otra molécula de ADN. (2) Si los iones Mg ²⁺ están en exceso, RecBCD corta ambas hebras de ADN endonucleolíticamente, aunque la cola 5' se corta con menos frecuencia (Figura 3). ^{[ 14 ]} Cuando RecBCD encuentra un sitio Chi en la hebra que termina en 3', el desenrollamiento se detiene y la digestión de la cola 3' se reduce. ^{[ 15 ]} Cuando RecBCD reanuda el desenrollamiento, ahora corta la hebra opuesta ( es decir , la cola 5') ^{[ 16 ] [ 17 ]} y carga la proteína RecA en la hebra que termina en 3'. ^{[ 12 ]} Después de completar la reacción en una molécula de ADN, la enzima ataca rápidamente un segundo ADN, en el que ocurren las mismas reacciones que en el primer ADN.

Aunque ninguna de las reacciones se ha verificado mediante el análisis del ADN intracelular, debido a la naturaleza transitoria de los intermediarios de reacción, la evidencia genética indica que la primera reacción imita más fielmente la que ocurre en las células. ^{[ 2 ]} Por ejemplo, la actividad de Chi está influenciada por los nucleótidos en su extremo 3', tanto en células como en reacciones con exceso de ATP, pero no con exceso de Mg ²⁺ [PMIDs 27401752, 27330137]. Los mutantes de RecBCD que carecen de actividad exonucleasa detectable conservan una alta actividad del punto caliente de Chi en las células y cortes en Chi fuera de las células. ^{[ 18 ]} Un sitio Chi en una molécula de ADN en las células reduce o elimina la actividad de Chi en otro ADN, lo que quizás refleje el desensamblaje dependiente de Chi de RecBCD observado in vitro en condiciones de exceso de ATP y cortes de ADN en Chi. ^{[ 19 ] [ 20 ]}

En ambas condiciones de reacción, la hebra 3' permanece intacta después de Chi. La proteína RecA se carga activamente en la cola 3' mediante RecBCD. ^{[ 12 ]} En algún punto indeterminado, RecBCD se disocia del ADN, aunque puede desenrollar al menos 60 kb de ADN sin desprenderse. RecA inicia el intercambio de la hebra de ADN a la que está unida con la hebra idéntica, o casi idéntica, en un dúplex de ADN intacto; este intercambio de hebras genera una molécula de ADN conjunta, como un bucle D (Figura 2). Se cree que la molécula de ADN conjunta se resuelve mediante replicación iniciada por la hebra invasora con extremo 3' que contiene Chi o mediante la escisión del bucle D y la formación de una unión de Holliday. La unión de Holliday puede resolverse en ADN lineal por el complejo RuvABC o disociarse por la proteína RecG . Cada uno de estos eventos puede generar ADN intacto con nuevas combinaciones de marcadores genéticos por los que los ADN parentales pueden diferir. Este proceso, la recombinación homóloga , completa la reparación de la rotura de doble cadena del ADN.

Las enzimas RecD se dividen en dos grupos: RecD1 (conocida como RecD) y RecD2. ^{[ 21 ]} Muchos organismos poseen un gen recD aunque no estén presentes los otros miembros del complejo recBCD, es decir, rec B y recC. ^{[ 22 ]} Por ejemplo, la bacteria Deinococcus radiodurans , que posee una extraordinaria capacidad de reparación del ADN , es un ejemplo de organismo que no posee un gen recB ni recC , pero sí un gen recD . ^{[ 22 ]} En la bacteria Escherichia coli , la proteína RecD forma parte del complejo RecBCD, ampliamente estudiado, que es necesario para la reparación recombinacional del ADN (como se describió anteriormente). En la bacteria Bacillus subtilis , la proteína RecD2 actúa como modulador del reinicio de la replicación y también como modulador de la recombinasa RecA . ^{[ 21 ]} RecD2 puede inhibir eventos de recombinación no deseados cuando las horquillas de replicación se detienen, y también puede tener un papel en el desplazamiento de la proteína RecA de los intermediarios de recombinación para permitir el avance de la horquilla de replicación. ^{[ 21 ]}

RecBCD es una enzima modelo para el uso de la fluorescencia de molécula única como técnica experimental para comprender mejor la función de las interacciones proteína-ADN. ^{[ 23 ]} La enzima también es útil para eliminar ADN lineal, ya sea de cadena simple o doble, de preparaciones de ADN circular de doble cadena, puesto que requiere un extremo de ADN para su actividad.

• Exodesoxirribonucleasa+V en los Encabezamientos de Materia Médica (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU.
• Exodesoxirribonucleasa+V,+E+coli en los Encabezamientos de Materia Médica (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU.
• CE 3.1.11.5