Prueba de extensión de poli(A)

La prueba de extensión de poli(A) (ePAT) describe un método para determinar la longitud de la cola de poli(A) de las moléculas de ARNm . Fue desarrollada y descrita por A. Jänicke et al. en 2012.

El método consta de tres pasos separados: en el primer paso, el ARN poliadenilado se hibrida con un oligonucleótido de ADN que presenta una secuencia de poli-desoxitimidina en su extremo 5'. La polimerasa Klenow cataliza la elongación del extremo 3' del ARNm, utilizando el oligonucleótido de ADN como molde. Esta reacción se lleva a cabo a 25  °C. En el segundo paso, la síntesis de transcriptasa inversa extiende los oligonucleótidos de ADN que se han hibridado con el extremo 3' extendido del ARNm. Para asegurar que los oligómeros de ADN hibridados con secuencias internas de poli(A) no actúen como cebadores para la transcripción inversa, el segundo paso se realiza a 55  °C. Un tercer y último paso implica la amplificación del ADNc recién sintetizado mediante PCR . Esta PCR requiere un cebador específico para el gen y un cebador universal. El análisis de la longitud de los amplicones permite estimar la secuencia flanqueada por los dos cebadores, es decir, la longitud de la cola de poli(A) del ARNm de la muestra.

Según los autores, la medición de la longitud de las colas de poli(A) y su distribución entre diferentes transcritos, este método puede utilizarse para determinar el estado de traducción de la célula en lugar del análisis más laborioso de los estados de traducción de proteínas. ^{[ 1 ]}