Fraccionamiento del flujo de campo

La relación entre el campo de fuerza de separación y el tiempo de retención se puede derivar de principios fundamentales. Consideremos dos poblaciones de partículas dentro del canal FFF. El campo transversal impulsa ambas nubes de partículas hacia la pared inferior de "acumulación". En oposición a este campo de fuerza se encuentra la difusión natural de las partículas, o movimiento browniano , que produce un movimiento contrario. Cuando estos dos procesos de transporte alcanzan el equilibrio, la concentración de partículas c se aproxima a la función exponencial de la elevación x por encima de la pared de acumulación, como se ilustra en la ecuación ( 1 ).

${\displaystyle \ell }$representa la elevación característica de la nube de partículas. Esto se relaciona con la altura promedio que alcanza la nube de partículas dentro del canal y solo cuando el valor para${\displaystyle \ell }$es diferente para la separación de poblaciones de partículas ocurrirá. El ${\displaystyle \ell }$de cada componente puede relacionarse con la fuerza aplicada sobre cada partícula individual o con la relación entre el coeficiente de difusión D y la velocidad de deriva U. ^{[ 13 ]}

k es la constante de Boltzmann , T es la temperatura absoluta y F es la fuerza ejercida sobre una partícula por el campo de fuerza. Esto demuestra que el valor característico de elevación es inversamente proporcional a la fuerza aplicada. Por lo tanto, F rige el proceso de separación . En consecuencia, al variar la intensidad del campo, se puede controlar la separación para alcanzar niveles óptimos.

La velocidad V de una nube de moléculas es simplemente la velocidad media de una distribución exponencial incrustada en un perfil de flujo parabólico.

El tiempo de retención, tr _, se puede escribir como:

Donde L es la longitud del canal.

En FFF, la retención se suele expresar en términos de la relación de retención, que es el tiempo muerto t ₀ (emergencia de un trazador no retenido) dividido por el tiempo de retención t _r . La ecuación de retención queda entonces de la siguiente manera:

dónde${\displaystyle \lambda }$es${\displaystyle \ell }$dividido por w, el espesor o altura del canal. Sustituyendo kT/F en lugar de${\displaystyle \ell }$Ilustra la relación de retención con respecto a la fuerza transversal aplicada.

Para un funcionamiento eficiente, el valor del espesor del canal w supera con creces${\displaystyle \ell }$Cuando esto ocurre, el término entre paréntesis se aproxima a la unidad. Por lo tanto, la ecuación 5 puede aproximarse como:

Así, t _r es aproximadamente proporcional a F. La separación de las bandas de partículas X e Y, representada por el incremento finito ∆t _r en sus tiempos de retención, se logra solo si el incremento de fuerza ∆F entre ellas es suficiente. Para que esto ocurra, se requiere una diferencia de fuerza de tan solo 10 ^{−16 N.}

La magnitud de F y ∆F depende de las propiedades de las partículas, la intensidad del campo y el tipo de campo. Esto permite variaciones y adaptaciones de la técnica. A partir de este principio básico, han evolucionado muchas formas de FFF, que varían según la naturaleza de la fuerza de separación aplicada y el rango de tamaño molecular al que se dirigen.

De estas técnicas, la citometría de flujo FFF fue la primera en ofrecerse comercialmente. La citometría de flujo FFF separa las partículas según su tamaño, independientemente de su densidad, y puede medir macromoléculas en el rango de 1  nm a 1  μm. En este sentido, es la subtécnica FFF más versátil disponible. El flujo transversal en la citometría de flujo FFF entra a través de una frita porosa en la parte superior del canal y sale a través de una frita de membrana semipermeable en la pared de acumulación (es decir, la pared inferior). El flujo simétrico ha sido reemplazado por el flujo asimétrico en las últimas dos décadas.

La citometría de flujo de fibra hueca (HF5) fue desarrollada por Lee et al . (1974). ^{[ 14 ]} La HF5 se ha aplicado al análisis de proteínas y otras macromoléculas. La HF5 fue la primera forma de citometría de flujo de fibra hueca que se desarrolló en 1974. La ventaja es que la HF5 ofrece una unidad de canal desechable que se puede reemplazar fácilmente en aplicaciones rutinarias. Una de las desventajas de la HF5 es la limitada selección de materiales de membrana; solo están disponibles las membranas de polietersulfona (PES). Actualmente, la HF5 no se utiliza ampliamente debido a la falta de flexibilidad y las limitaciones en la carga de muestras.

Por otro lado, la cromatografía de flujo asimétrico ( AF4 ) cuenta con una única membrana semipermeable en la pared inferior del canal. El flujo transversal se genera, por lo tanto, por la salida del líquido portador por la parte inferior del canal. Esto proporciona una separación extremadamente suave y un rango de separación ultra amplio. La mayoría de los instrumentos de FFF en uso son sistemas AF4. Sus principales aplicaciones se encuentran en la investigación y el desarrollo farmacéutico para proteínas, virus y partículas similares a virus, y liposomas. La AF4 también se ha combinado con la cromatografía monolítica de inmunoafinidad para el análisis de vesículas extracelulares derivadas del plasma . Se han aislado vesículas derivadas de plaquetas CD61-positivas utilizando un disco monolítico anti-CD61 y se han fraccionado por tamaño mediante AF4 acoplada a detección de dispersión de luz dinámica y multiángulo. ^{[ 15 ]} Posteriormente se utilizó un sistema automatizado de cromatografía de inmunoafinidad en línea AF4 para aislar y fraccionar vesículas derivadas de plaquetas CD61-positivas y vesículas CD9-positivas en subpoblaciones basadas en el tamaño. ^{[ 16 ]} Las fracciones de EV resultantes se caracterizaron además mediante espectroscopia Raman y cromatografía de gases bidimensional completa . ^{[ 17 ]} Las subpoblaciones de EV fraccionadas por AF4 relacionadas también se utilizaron en estudios de microbalanza de cristal de cuarzo de unión de anticuerpos e ICAM-1. ^{[ 18 ]}

La técnica AF4 puede aplicarse en disolventes acuosos y orgánicos, por lo que también permite separar polímeros orgánicos. La fraccionación por flujo de campo asimétrico a alta temperatura está disponible para la separación de polímeros de alta y ultra alta masa molar solubles a temperaturas superiores a 150 °C.

La técnica FFF térmica, como su nombre indica, establece una fuerza de separación aplicando un gradiente de temperatura al canal. La pared superior del canal se calienta y la inferior se enfría, impulsando los polímeros y las partículas hacia la pared fría por difusión térmica. La FFF térmica se desarrolló como una técnica para separar polímeros sintéticos en disolventes orgánicos. Esta técnica es única entre las técnicas FFF, ya que permite separar macromoléculas tanto por masa molar como por composición química, posibilitando la separación de fracciones de polímeros con el mismo peso molecular. Actualmente, esta técnica es ideal para la caracterización de polímeros, geles y nanopartículas.

Una de las principales ventajas de la FFF térmica es la simplicidad y la definición precisa de las dimensiones del canal de separación, lo que posibilita la calibración universal entre laboratorios o instrumentos, ya que las constantes de calibración de la FFF térmica describen con precisión la relación entre el coeficiente de difusión ordinaria (molecular) D y el coeficiente de difusión térmica (o movilidad termoforética) D _T , que dependen únicamente del polímero. Por lo tanto, la calibración universal de la ThFFF es transferible entre instrumentos y laboratorios, mientras que la conocida calibración universal de la cromatografía de exclusión por tamaño solo es transferible entre polímeros en el mismo instrumento. ^{[ 19 ]}

La fraccionación de células delgadas de flujo dividido (SPLITT) ^{[ 20 ]} es una técnica especial de FFF preparativa que utiliza la gravedad ^{[ 21 ]} , la electricidad ^{[ 22 ]} o las diferencias de difusión para la separación continua de partículas de más de μm. El sistema SPLITT tiene dos entradas y dos salidas. Se realiza bombeando la muestra sumergida en un líquido hacia una entrada al inicio del canal a un caudal bajo, mientras que simultáneamente se bombea un líquido portador hacia la segunda entrada a un caudal mucho mayor. Al controlar las relaciones de caudal de las dos corrientes de entrada y las dos corrientes de salida, se puede controlar la separación y los componentes de la muestra se separan en dos fracciones de tamaño distinto. El uso exclusivo de la gravedad como fuerza de separación hace que SPLITT sea la técnica de FFF menos sensible, limitada a partículas de más de 1  μm.

En la centrifugación en flujo continuo (FFF) centrífuga, el campo de separación se genera mediante una fuerza centrífuga. El canal tiene forma de anillo y gira a velocidades programables durante el proceso. El flujo y la muestra se bombean al canal y se centrifugan, lo que permite al operador separar las partículas por masa (tamaño y densidad). La ventaja de la FFF centrífuga reside en la alta resolución de tamaño que se puede lograr variando la fuerza aplicada, ya que el tamaño de partícula es proporcional a la masa de partícula elevada al cubo.

La ventaja única que ofrece la técnica FFF centrífuga radica en su capacidad para lograr alta resolución con una densidad de flotación suficiente. Esto permite la separación de partículas con una diferencia de tamaño de tan solo el 5 %.

La FFF centrífuga tiene la ventaja de que las partículas y macromoléculas se pueden separar por densidad de partículas, en lugar de solo por tamaño de partícula. En este caso, dos nanopartículas de oro y plata de tamaño idéntico se pueden separar en dos picos, según las diferencias de densidad en las nanopartículas de oro y plata,

En las separaciones AF4, la relación masa/tiempo es 1:1. Al añadir el tercer parámetro de densidad a la FFF centrífuga, se obtiene una relación más cercana a masa:tiempo elevada a la tercera potencia. Esto resulta en una distinción significativamente mayor entre los picos y una resolución notablemente mejorada. Esto puede ser particularmente útil para productos novedosos, como materiales compuestos y polímeros recubiertos que contienen nanopartículas, es decir, partículas que pueden no variar en tamaño pero sí en densidad. De esta manera, dos partículas de tamaño idéntico pueden separarse en dos picos, siempre que su densidad sea diferente.

La limitación del método reside en el límite inferior de tamaño, que depende de la densidad de la muestra. Específicamente para muestras biológicas, el límite se sitúa en el orden de 20 a 50  nm de diámetro.

En la FFF eléctrica se aplica una corriente eléctrica transversal (CC) que crea un campo eléctrico. Dependiendo de la carga de los componentes de la muestra, se induce una velocidad de deriva electroforética , contrarrestada por la difusión debida al movimiento browniano, por lo que la separación depende de la relación entre la movilidad electroforética y el tamaño. La aplicación de la FFF eléctrica ha sido limitada y actualmente se utiliza con poca frecuencia. Se han desarrollado otras modificaciones, como la FFF eléctrica cíclica, donde se aplica una corriente alterna especial . Esta permite la separación según la movilidad electroforética. Otra variante es la FFF de flujo asimétrico eléctrico (EAF4), donde se aplica un campo eléctrico además de un campo de flujo transversal. La EAF4 supera la limitación de la FFF eléctrica pura, que tiene una resolución baja y sufre de contaminación por productos de electrólisis y burbujas en la salida del canal, lo que compromete las señales del detector. ^{[ 23 ]}