Hispanopedia Wiki
Articulo de referencia

Flash-EDT 2

2 ","function":"displaytitle"},"params":{},"i":0}}]}"> FlAsH-EDT 2 es un compuesto organoarsénico con fórmula molecular C 24 H 18 As 2 O 5 S 4 . Su estructura se basa en un núcl...

Hispanopedia WikiContenido en espanolLectura gratuita

FlAsH-EDT 2 es un compuesto organoarsénico con fórmula molecular C 24 H 18 As 2 O 5 S 4 . Su estructura se basa en un núcleo de fluoresceína con dos sustituyentes 1,3,2-ditiarsolano . Se utiliza en investigación bioanalítica como marcador fluorescente para visualizar proteínas en células vivas. [ 1 ] FlAsH-EDT 2 es una abreviatura de fluorescina ar sénical hairpin binder - ethane dithiol , y es un sólido fluorogénico de color amarillo pálido o rosado. Tiene una fórmula semiestructural (C 2 H 4 AsS 2 ) 2 -(C 13 H 5 O 3 )-C 6 H 4 COOH , que representa los sustituyentes ditiarsolano unidos al núcleo de hidroxi xantona , unido a una molécula o -sustituida de ácido benzoico .

FlAsH-EDT 2 se utiliza para el marcaje sitio-específico, uniéndose selectivamente a proteínas que contienen el motivo de tetracisteína ( TC) Cys-Cys-Xxx-Xxx-Cys-Cys y volviéndose fluorescente al unirse. Presenta unión no específica a proteínas endógenas ricas en cisteína, lo que significa que se une a sitios distintos del de interés (CCXXCC). La optimización posterior del motivo TC ha revelado una mayor afinidad de unión de FlAsH para un motivo CCPGCC, [ 2 ] y un mayor rendimiento cuántico cuando el motivo de tetracisteína está flanqueado por residuos específicos (HRWCCPGCCKTF o FLNCCPGCCMEP). [ 3 ]

Preparación

Paso 1 : HgO en TFA ; Paso 2 : AsCl 3 , seguido de Pd(OAc) 2 y DIEA ; Paso 3 : H 2 EDT en acetona acuosa.

FlAsH-EDT 2 se puede preparar en tres pasos a partir de fluoresceína (ver figura). [ 1 ]

Formación del aducto FlAsH-TC

Numerosos estudios demuestran que los compuestos de arsénico trivalente se unen a pares de residuos de cisteína. Esta unión es responsable de la toxicidad de muchos compuestos de arsénico. [ 4 ] La unión se revierte mediante el 1,2-etanoditiol, que se une fuertemente a los compuestos de arsénico, como lo demuestra la estabilidad de FlAsH-EDT 2 . [ 5 ] Este fuerte enlace azufre-arsénico puede regularse, a su vez, diseñando un dominio peptídico que exhiba mayor afinidad por el arsénico, como el motivo de tetracisteína. Al modular la distancia entre los dos pares de residuos de cisteína y el espacio entre los centros de arsénico de FlAsH-EDT 2 , se podría lograr un enlace ditiol-arsénico cooperativo y energéticamente favorable. [ 6 ]

Formación del aducto FlAsH-TC

La unión de FlAsH-EDT 2 está, por lo tanto, sujeta a un equilibrio. La formación del aducto FlAsH-péptido puede verse favorecida en bajas concentraciones de EDT (por debajo de 10 μM ) y revertirse en altas concentraciones de EDT (por encima de 1 mM). [ 6 ]  

Propiedades

FlAsH se vuelve fluorescente al unirse al motivo de tetracisteína. Se excita a 508  nm y emite a 528  nm, un color verde amarillento, de fluoresceína libre. El rendimiento cuántico es de 0,49 para 250  nM de FlAsH unido a un péptido modelo que contiene tetracisteína en una solución salina tamponada con fosfato a pH 7,4. [ 6 ]

En general, FlAsH-EDT 2 tiene eficiencias cuánticas de fluorescencia de 0,1 a 0,6 con límites de detección de varias μM para la etiqueta citosólica difusa y coeficientes de extinción de 30 a 80 L  mmol − 1  cm − 1 . El complejo FlAsH-péptido también ha demostrado transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) desde proteínas fluorescentes, como la proteína fluorescente cian mejorada (ECFP) de la proteína fluorescente verde (GFP). [ 7 ]

Solicitud

FlAsH-EDT 2 permite un marcaje fluorescente menos tóxico y más específico que es permeable a la membrana. [ 8 ] La modificación de la porción de fluoresceína también permite el análisis multicolor. [ 9 ] Se ha demostrado que es una buena alternativa a las proteínas fluorescentes verdes (GFP) con la ventaja de que FlAsH-EDT 2 es mucho más pequeño ( masa molar  <  1 kDa ) en comparación con las GFP (~30 kDa), por lo que minimiza la perturbación de la actividad de la proteína en estudio. [ 1 ] [ 10 ]  

Usar

En el pasado, FlAsH-EDT 2 se ha utilizado ampliamente para estudiar diversos eventos celulares in vivo y estructuras subcelulares en células animales, la proteína de la matriz del virus del Ébola y el plegamiento incorrecto de proteínas. Mediante microscopía electrónica, FlAsH-EDT 2 también se utiliza para estudiar los procesos de transporte de proteínas in situ . [ 11 ] Más recientemente, se utilizó en un estudio más extenso de células vegetales como Arabidopsis y tabaco. [ 12 ]

Referencias

  1. 1 2 3 Adams, Stephen R.; Tsien, Roger Y. (2008). "Preparación de los biarénicos permeables a la membrana FlAsH-EDT 2 y ReAsH-EDT 2 para el marcaje fluorescente de proteínas marcadas con tetracisteína" . Nat. Protoc. 3 (9): 1527– 1534. doi : 10.1038/nprot.2008.144 . PMC 2843588 . PMID 18772880 .  
  2. ↑ Adams, Stephen R.; Campbell, Robert E.; Gross, Larry A.; Martin, Brent R.; Walkup, Grant K.; Yao, Yong; Llopis, Juan; Tsien, Roger Y. (2002). "Nuevos ligandos biarénicos y motivos de tetracisteína para el marcaje de proteínas in vitro e in vivo: síntesis y aplicaciones biológicas". Journal of the American Chemical Society . 124 (21): 6063– 6076. Bibcode : 2002JAChS.124.6063A . doi : 10.1021/ja017687n . PMID 12022841 . 
  3. ↑ Martin, Brent R.; Giepmans, Ben NG; Adams, Stephen R.; Tsien, Roger Y. (2005). "Optimización basada en células de mamíferos del motivo de tetracisteína de unión a biarénico para mejorar la fluorescencia y la afinidad". Nature Biotechnology . 23 (10): 1308– 1314. doi : 10.1038/nbt1136 . PMID 16155565 . S2CID 16456334 .  
  4. ↑ Kalef, Edna; Gitler, Carlos (1994). "Purificación de proteínas que contienen ditioles vecinales mediante cromatografía de afinidad basada en arsénico". En Sies, Helmut (ed.). Radicales de oxígeno en sistemas biológicos, Parte C. Métodos en enzimología . Vol. 233. Academic Press . pp. 395–403 . doi : 10.1016/S0076-6879(94)33046-8 . ISBN   9780080883465. PMID 8015475 . 
  5. ↑ Whittaker, Victor P. (1947). " Una investigación experimental de la 'hipótesis del anillo' de la toxicidad del arsénico" . Biochem. J. 41 (1): 56– 62. doi : 10.1042/bj0410056 . PMC 1258423. PMID 16748119 .  
  6. 1 2 3 Griffin, B. Albert; Adams, Stephen R.; Tsien, Roger Y. (1998). "Etiquetado covalente específico de moléculas de proteínas recombinantes dentro de células vivas". Science . 281 (5374): 269– 272. Bibcode : 1998Sci...281..269G . doi : 10.1126/science.281.5374.269 . PMID 9657724 . 
  7. ↑ Adams, Stephen R.; Campbell, Robert E.; Gross, Larry A.; Martin, Brent R.; Walkup, Grant K.; Yao, Yong; Llopis, Juan; Tsien, Roger Y. (2002). "Nuevos ligandos biarénicos y motivos de tetracisteína para el marcaje de proteínas in vitro e in vivo: síntesis y aplicaciones biológicas". J. Am. Chem. Soc. 124 (21): 6063– 6076. Bibcode : 2002JAChS.124.6063A . doi : 10.1021/ja017687n . PMID 12022841 . 
  8. ↑ Hoffmann, Carsten; Gaietta, Guido; Zürn, Alexander; Adams, Stephen R.; Terrillon, Sonia; Ellisman, Mark H.; Tsien, Roger Y.; Lohse, Martin J. (2010). "Marcaje fluorescente de proteínas marcadas con tetracisteína en células intactas" . Nature Protocols . 5 (10): 1666– 1677. doi : 10.1038/nprot.2010.129 . PMC 3086663. PMID 20885379 .  
  9. ↑ Kit de detección de tetracisteína intracelular TC-FlAsH™ II (fluorescencia verde), para imágenes de células vivas
  10. ↑ Griffin, B. Albert; Adams, Stephen R.; Jones, Jay; Tsien, Roger Y. (2000). "Marcaje fluorescente de proteínas recombinantes en células vivas con FlAsH". En Thorner, Jeremy; Emr, Scott D .; Abelson, John N. (eds.). Aplicaciones de genes quiméricos y proteínas híbridas, Parte B: Biología celular y fisiología . Métodos en enzimología . Vol. 327. Academic Press . pp. 565–578 . doi : 10.1016/S0076-6879(00)27302-3 . ISBN   9780080496825. PMID 11045009 . 
  11. ↑ Gaietta, Guido; Deerinck, Thomas J.; Adams, Stephen R.; Bouwer, James; Tour, Oded; Laird, Dale W.; Sosinsky, Gina E.; Tsien, Roger Y. ; Ellisman, Mark H. (2002). "Imágenes multicolores y de microscopía electrónica del tráfico de conexinas". Science . 296 (5567): 503– 507. Bibcode : 2002Sci...296..503G . doi : 10.1126/science.1068793 . PMID 11964472 . S2CID 16397816 .  
  12. ↑ Estévez, José M.; Somerville, Chris (2006). "Imágenes fluorescentes de células vivas basadas en FlAsH de péptidos sintéticos expresados ​​en Arabidopsis y tabaco" . BioTechniques . 41 (5): 569– 574. doi : 10.2144/000112264 . PMID 17140113 .