cromatografía en columna

La cromatografía en columna es un método cromatográfico utilizado en química analítica para separar los componentes individuales ( analitos ) de una mezcla. La mezcla es transportada por un disolvente ( eluyente ) que forma la fase móvil . La fase móvil se desplaza a través de una columna rellena de partículas sólidas ( fase estacionaria ). Los componentes se adsorben a la fase estacionaria a diferentes velocidades, por lo que salen de la columna en momentos distintos. Esto permite la separación de los componentes.

La técnica es ampliamente aplicable, ya que se pueden utilizar diversos adsorbentes (fase normal, fase inversa , etc.) con una amplia gama de disolventes. Se puede aplicar a escalas que van desde microgramos hasta kilogramos. La principal ventaja de la cromatografía en columna es su coste relativamente bajo y la posibilidad de reemplazar la fase estacionaria tras su uso. Esto último evita la contaminación cruzada y la degradación de la fase estacionaria por reciclaje. La fase móvil se desplaza por gravedad, gas comprimido o bombas presurizadas (como en la cromatografía líquida de alta resolución ).

Antes de realizar la cromatografía en columna, se suele realizar primero una cromatografía en capa fina con una pequeña cantidad de la muestra, para observar cómo se comporta la mezcla de compuestos al purificarse mediante cromatografía en columna. Esto permite al investigador optimizar la combinación de fases móvil y estacionaria para esa muestra en particular.

Se prepara una columna rellenando un tubo cilíndrico de vidrio o plástico con un adsorbente sólido. El tamaño del tubo dependerá de la cantidad de compuesto que se aísle. La base del tubo contiene un filtro para retener la fase sólida. Este filtro puede ser un tapón de algodón o lana de vidrio , o bien una frita de vidrio . En la parte superior de la columna se puede acoplar un depósito de disolvente.

Generalmente se utilizan dos métodos para preparar una columna: el método seco y el método húmedo . Para el método seco, la columna se llena primero con polvo de fase estacionaria seco, seguido de la adición de la fase móvil, que se hace pasar a través de la columna hasta que esté completamente húmeda, y a partir de este punto nunca se deja que se seque. ^{[ 1 ]} Para el método húmedo, se prepara una suspensión del eluyente con el polvo de fase estacionaria y luego se vierte cuidadosamente en la columna. La parte superior de la sílice debe ser plana, y puede protegerse con una capa de arena. El eluyente se hace pasar lentamente a través de la columna para avanzar el material orgánico.

Los componentes individuales son retenidos de forma diferente por la fase estacionaria y se separan entre sí mientras se desplazan a distintas velocidades a través de la columna con el eluyente. Al final de la columna, eluyen uno a uno. Durante todo el proceso cromatográfico, el eluyente se recoge en una serie de fracciones . Las fracciones pueden recogerse automáticamente mediante colectores de fracciones. La productividad de la cromatografía puede incrementarse utilizando varias columnas a la vez. En este caso, se utilizan colectores de flujo múltiple. La composición del flujo de eluyente puede monitorizarse y cada fracción se analiza para detectar compuestos disueltos, por ejemplo, mediante cromatografía analítica, espectros de absorción UV o fluorescencia . Los compuestos coloreados (o los compuestos fluorescentes con la ayuda de una lámpara UV) pueden observarse a través de la pared de vidrio como bandas en movimiento.

En la cromatografía de columna, la columna contiene un relleno de partículas sólidas, polvos finamente molidos o geles. Esto se denomina fase estacionaria o adsorbente . Generalmente está compuesta de gel de sílice o alúmina . En el pasado, también se utilizaba con frecuencia celulosa en polvo.

Existe una amplia gama de fases estacionarias disponibles para diferentes tipos de cromatografía en columna: cromatografía de intercambio iónico , cromatografía de fase inversa (RP), cromatografía de afinidad o adsorción en lecho expandido (EBA). La fase sólida puede ser microporosa para aumentar la superficie, aunque la EBA utiliza un lecho fluidizado .

En general, se debe utilizar mucha más fase estacionaria que mezcla de analito. En particular, para la cromatografía en columna de sílice, por cada gramo de masa seca de la mezcla de analito, se deben utilizar entre 20 y 100 gramos de fase estacionaria. Usar más sílice aumentaría el poder de resolución de la cromatografía, pero también la haría más lenta. ^{[ 2 ]}

La fase móvil o eluyente es un disolvente o una mezcla de disolventes que se utiliza para mover los compuestos a través de la columna.

El criterio principal para elegir un eluyente adecuado se refiere al factor de retención :

• El factor de retención del compuesto de interés debe estar alrededor de 0,2 - 0,3 para minimizar el tiempo y la cantidad de eluyente necesarios para realizar la cromatografía.

• Los demás compuestos deberían tener factores de retención bastante diferentes a los del compuesto de interés.

Para elegir un buen eluyente, se realizan múltiples pruebas preliminares a pequeña escala, a menudo utilizando cromatografía de capa fina (TLC) con la misma fase estacionaria, empleando disolventes de diferente polaridad, hasta encontrar un sistema de disolventes adecuado.

Los disolventes comunes para la fase móvil, en orden de polaridad creciente, incluyen hexano , diclorometano , acetato de etilo , acetona y metanol . ^{[ 3 ]} Un sistema de disolventes común es la mezcla de hexano y acetato de etilo. Las proporciones se ajustan de manera que el compuesto objetivo tenga un factor de retención de 0,2 a 0,3.

Contrariamente a la creencia popular, el metanol por sí solo puede utilizarse como eluyente para compuestos altamente polares y no disuelve el gel de sílice.

Se puede optimizar el caudal del eluyente . Un caudal mayor reduce el tiempo necesario para realizar la cromatografía en columna y, por lo tanto, disminuye la difusión, mejorando así el poder de resolución. Sin embargo, si el caudal es demasiado alto, el analito no logrará equilibrarse entre la fase estacionaria y la fase móvil (véase la ecuación de Van Deemter ).

Para aumentar el caudal en una cromatografía de columna por gravedad, se puede incrementar la altura de la columna de eluyente fresco por encima de la fase estacionaria o disminuir los controles de presión. También se puede aumentar utilizando una bomba o gas comprimido (p. ej., aire, nitrógeno o argón ) para impulsar el solvente a través de la columna (cromatografía de columna rápida). ^{[ 4 ] [ 5 ]}

El tamaño de partícula de la fase estacionaria suele ser más fino en la cromatografía en columna rápida que en la cromatografía en columna por gravedad. Por ejemplo, uno de los grados de gel de sílice más utilizados en la primera técnica es el de malla 230-400 (40-63 μm), mientras que la segunda técnica normalmente requiere gel de sílice de  malla 70-230 (63-200 μm). ^{[ 6 ]} 

La cromatografía en columna requiere mucho tiempo. Muchos fabricantes, como Biotage, Buchi, Interchim y Teledyne Isco, han desarrollado sistemas automatizados de cromatografía flash que minimizan la intervención humana en el proceso de purificación.

Estos sistemas se conocen comúnmente como cromatografía líquida de baja presión (LPLC). Incluyen componentes que normalmente se encuentran en sistemas de cromatografía líquida de alta presión (HPLC), más costosos, como una bomba de gradiente, puertos de inyección de muestras, un detector UV y un colector de fracciones para recoger el eluyente, pero operan a una presión menor (generalmente entre 350 y 525 kPa o entre 50,8 y 76,1 psi ). Por lo general, estos sistemas automatizados pueden separar muestras desde unos pocos miligramos hasta cantidades industriales de varios kilogramos, y son más económicos y rápidos que realizar múltiples inyecciones en sistemas HPLC preparativos.  

La resolución (o la capacidad de separar una mezcla) de un sistema LPLC es menor, ya que el material de relleno en una columna HPLC puede ser mucho más pequeño, típicamente solo 5 micrómetros. Esto aumenta la superficie de la fase estacionaria para las interacciones y proporciona una mejor separación. Sin embargo, los medios de relleno pequeños causan una alta contrapresión, de ahí la cromatografía líquida de "alta presión".

Las columnas LPLC suelen estar rellenas de sílice de aproximadamente 50 micrómetros, lo que reduce la contrapresión y la resolución, y además elimina la necesidad de costosas bombas de alta presión. Los fabricantes están empezando a utilizar sistemas de cromatografía flash de mayor presión, que operan por encima de 1 MPa (150 psi) , denominándolos "cromatografía líquida de presión media" (MPLC).  

Normalmente, la cromatografía de columna se configura con bombas peristálticas, tampones que fluyen y la muestra de solución que pasa por la parte superior de la columna. Las soluciones y los tampones atraviesan la columna, donde un colector de fracciones al final del sistema recoge las muestras eluidas. Antes de la recolección de fracciones, las muestras eluidas de la columna pasan por un detector, como un espectrofotómetro o un espectrómetro de masas, para poder determinar la concentración de las muestras separadas en la mezcla de solución de muestra.

Por ejemplo, si se quisieran separar dos proteínas diferentes con distinta capacidad de unión a la columna a partir de una muestra en solución, un buen detector sería un espectrofotómetro que utilice una longitud de onda de 280  nm. Cuanto mayor sea la concentración de proteína que pasa a través de la solución eluida a través de la columna, mayor será la absorbancia a esa longitud de onda.

Debido a que la cromatografía en columna implica un flujo constante de solución eluida que pasa a través del detector a concentraciones variables, el detector debe graficar la concentración de la muestra eluida en función del tiempo. Esta gráfica de concentración de la muestra en función del tiempo se denomina cromatograma.

El objetivo principal de la cromatografía es separar los diferentes componentes de una mezcla de soluciones. La resolución indica el grado de separación entre los componentes de la mezcla. Cuanto mayor sea la resolución del cromatograma, mejor será la separación de las muestras que proporciona la columna. Estos datos son útiles para determinar las propiedades de separación de la columna para esa muestra en particular. La resolución se puede calcular a partir del cromatograma.

Las distintas curvas del diagrama representan diferentes perfiles de concentración de elución de la muestra a lo largo del tiempo, según su afinidad con la resina de la columna. Para calcular la resolución, se requieren el tiempo de retención y el ancho de la curva.

El tiempo de retención es el tiempo transcurrido desde el inicio de la detección de la señal por el detector hasta la altura máxima del perfil de concentración de elución de cada muestra diferente.

El ancho de la curva es la anchura de la curva del perfil de concentración de las diferentes muestras en el cromatograma en unidades de tiempo.

Un método simplificado para calcular la resolución del cromatograma consiste en utilizar el modelo de placa. ^{[ 7 ]} Este modelo supone que la columna se puede dividir en un número determinado de secciones o placas, y que el balance de masas se puede calcular para cada placa individual. Este enfoque aproxima una curva de cromatograma típica a una distribución gaussiana . De este modo, el ancho de la curva se estima como cuatro veces la desviación estándar de la misma, 4σ. El tiempo de retención es el tiempo transcurrido desde el inicio de la detección de la señal hasta el momento en que se alcanza la altura máxima de la curva gaussiana.

A partir de las variables de la figura anterior, se pueden calcular la resolución, el número de placa y la altura de la placa del modelo de placa de columna.

Resolución${\textstyle R_{s}=2{\frac {t_{RB}-t_{RA}}{w_{A}+w_{B}}}}$, dónde

t _RB = tiempo de retención del soluto B

t _RA = tiempo de retención del soluto A

w _B = Ancho de la curva gaussiana del soluto B

w _A = Ancho de la curva gaussiana del soluto A

Número de matrícula${\displaystyle N=(4t_{R}/w)^{2}}$.

Altura del plato${\displaystyle H=L/N}$, dónde${\displaystyle L}$es la longitud de la columna. ^{[ 7 ]}

En una columna de adsorción, la resina (fase estacionaria) está compuesta por microesferas. Partículas aún más pequeñas, como proteínas, carbohidratos, iones metálicos u otros compuestos químicos, se conjugan a las microesferas. Se asume que cada partícula de unión adherida a la microesfera se une en una proporción 1:1 con la muestra de soluto que atraviesa la columna y que necesita ser purificada o separada.

La unión entre la molécula diana que se va a separar y la molécula de unión en las perlas de la columna se puede modelar mediante una reacción de equilibrio simple K _eq = [CS]/([C][S]), donde K _eq es la constante de equilibrio , [C] y [S] son ​​las concentraciones de la molécula diana y la molécula de unión en la resina de la columna, respectivamente. [CS] es la concentración del complejo de la molécula diana unida a la resina de la columna. ^{[ 7 ]}

Partiendo de esta base, se pueden utilizar tres isotermas diferentes para describir la dinámica de unión de una cromatografía en columna: lineal, de Langmuir y de Freundlich.

La isoterma lineal se produce cuando la concentración de soluto que se necesita purificar es muy pequeña en relación con la molécula de unión. Por lo tanto, el equilibrio se puede definir como:

[CS] = K _eq [C].

Para aplicaciones a escala industrial, se debe tener en cuenta el número total de moléculas unidas a las perlas de resina de la columna, ya que es necesario considerar los sitios no ocupados. Las isotermas de Langmuir y Freundlich son útiles para describir este equilibrio. La isoterma de Langmuir viene dada por:

[CS] = (K _eq S _tot [C])/(1 + K _eq [C]), donde S _tot es el número total de moléculas unidas a las perlas.

La isoterma de Freundlich viene dada por:

[CS] = K _eq [C] ^1/n

La isoterma de Freundlich se utiliza cuando la columna puede unirse a muchas muestras diferentes en la solución que se necesita purificar. Debido a que las diferentes muestras tienen diferentes constantes de unión a las microesferas, existen muchos valores diferentes de K _eq . Por lo tanto, la isoterma de Langmuir no es un buen modelo de unión en este caso. ^{[ 7 ]}

• Cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC): separación de proteínas mediante cromatografía en columna.
• Cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC): cromatografía en columna que utiliza alta presión.

• Guía de cromatografía en columna rápida (pdf)
• Cromatografía de flujo radial