Flow-FISH

Flow-FISH (hibridación fluorescente in situ) es una técnica citogenética para cuantificar el número de copias de ARN o elementos repetitivos específicos en el ADN genómico de poblaciones celulares completas mediante la combinación de citometría de flujo con protocolos de tinción de hibridación fluorescente in situ citogenética . ^{[ 1 ] [ 2 ] [ 3 ]}

Flow-FISH se utiliza comúnmente para cuantificar la longitud de los telómeros , que son segmentos de ADN repetitivo (repeticiones hexaméricas TTAGGG) en los extremos distales de los cromosomas ^{[ 4 ]} en los glóbulos blancos humanos , y se publicó un método semiautomatizado para ello en Nature Protocols . ^{[ 1 ]} La longitud de los telómeros en los glóbulos blancos ha sido objeto de interés porque la longitud de los telómeros en estos tipos celulares (y también en otros tejidos somáticos ) disminuye gradualmente a lo largo de la vida humana, lo que da lugar a la senescencia celular , la apoptosis ^{[ 5 ]} o la transformación . ^{[ 6 ]} Se ha demostrado que esta disminución es un marcador sustituto de la disminución concomitante de la longitud de los telómeros del conjunto de células madre hematopoyéticas , siendo el linaje de los granulocitos el que proporciona la mejor indicación, presumiblemente debido a la ausencia de un subtipo de memoria de larga duración y a la renovación comparativamente rápida de estas células. ^{[ 7 ]}

Flow-FISH también es adecuado para la detección simultánea de ARN y proteínas . ^{[ 2 ]} Esto permite la identificación de células que no solo expresan un gen , sino que también lo traducen en proteína . Este tipo de Flow-FISH se ha utilizado para estudiar la infección latente de virus como el VIH-1 y el VEB , ^{[ 8 ] [ 9 ]} pero también para rastrear la expresión génica y la traducción a proteína en células individuales . ^{[ 2 ] [ 10 ]}

Flow-FISH fue publicado por primera vez en 1998 por Rufer et al. ^{[ 11 ]} como una modificación de otra técnica para analizar la longitud de los telómeros, Q-FISH , que emplea sondas de ácido nucleico peptídico ^{[ 12 ]} de una secuencia 3'-CCCTAACCCTAACCCTAA-5' marcada con un fluoróforo de fluorescina para teñir repeticiones teloméricas en preparaciones de metafase de células que han sido tratadas con colcemida , choque hipotónico y fijación a portaobjetos mediante tratamiento con metanol / ácido acético ^{[ 13 ].} Las imágenes de los puntos fluorescentes resultantes podrían analizarse mediante un programa informático especializado para obtener valores de fluorescencia cuantitativos que luego pueden utilizarse para estimar la longitud real de los telómeros. La fluorescencia producida por la tinción con sonda se considera cuantitativa porque el PNA se une preferentemente al ADN a bajas concentraciones de sales iónicas y en presencia de formamida , por lo que el dúplex de ADN puede no reformarse una vez que se ha fundido y hibridado con la sonda de PNA , lo que permite que la sonda sature su secuencia repetitiva objetivo (ya que no es desplazada del ADN objetivo por el ADN antisentido competidor en la hebra complementaria), lo que produce una lectura fiable y cuantificable de la frecuencia del objetivo de la sonda de PNA en un sitio cromosómico determinado después de lavar la sonda no unida. ^{[ 13 ]}

Innovación

A diferencia de Q-FISH, Flow-FISH utiliza las propiedades cuantitativas de retención de sondas PNA específicas de telómeros para cuantificar la fluorescencia media en una población de células, mediante el uso de un citómetro de flujo , en lugar de un microscopio de fluorescencia. ^{[ 14 ]} La principal ventaja de esta técnica es que elimina el tiempo requerido en Q-FISH para preparar preparaciones de metafase de células de interés, y que el análisis por citometría de flujo también es considerablemente más rápido que los métodos requeridos para adquirir y analizar portaobjetos preparados para Q-FISH. Flow-FISH permite así un análisis de mayor rendimiento de la longitud de los telómeros en leucocitos sanguíneos, que son una forma fácilmente disponible de muestra de tejido humano. Las versiones más recientes de la técnica flow-FISH incluyen una población de control interno de timocitos bovinos con una longitud de telómero conocida detectada por TRF o análisis de fragmentos de restricción de telómeros con la que se puede comparar la fluorescencia de una muestra desconocida dada. Debido a que los timocitos bovinos captan el colorante LDS751 en menor medida que sus homólogos humanos, pueden diferenciarse de forma fiable mediante la representación gráfica y la selección de las poblaciones deseadas. Otros tipos celulares que en el pasado no han demostrado ser buenos candidatos para la técnica flow-FISH pueden analizarse mediante la extracción de núcleos y la aplicación directa de la técnica. ^{[ 15 ]}