Espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia

La espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia ( FCCS ) es una técnica espectroscópica que examina las interacciones de partículas fluorescentes de diferentes colores a medida que se difunden aleatoriamente a través de un volumen de detección microscópico a lo largo del tiempo, en condiciones estables. ^{[ 1 ]}

Eigen y Rigler introdujeron por primera vez el método de espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia (FCCS) en 1994. Posteriormente, en 1997, Schwille implementó experimentalmente este método. ^{[ 2 ] [ 3 ]}

La FCCS es una extensión del método de espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS) que utiliza dos moléculas fluorescentes en lugar de una que emiten diferentes colores. La técnica mide fluctuaciones coincidentes de intensidad verde y roja de distintas moléculas que se correlacionan si las partículas marcadas con verde y rojo se mueven juntas a través de un volumen confocal predefinido. ^{[ 2 ]} La FCCS utiliza dos especies que se marcan independientemente con dos sondas fluorescentes diferentes de distintos colores. Estas sondas fluorescentes se excitan y detectan mediante dos fuentes de luz láser y detectores diferentes, generalmente etiquetados como "verde" y "rojo". Al combinar la FCCS con un microscopio confocal , se destacan las capacidades de la técnica, ya que es posible detectar moléculas fluorescentes en volúmenes de femtolitros dentro del rango nanomolar, con una alta relación señal-ruido y en una escala de tiempo de microsegundos. ^{[ 4 ]}

La función de correlación cruzada normalizada se define para dos especies fluorescentes, G y R, que son canales verdes y rojos independientes, respectivamente:

${\displaystyle \ G_{GR}(\tau )=1+{\frac {\langle \delta I_{G}(t)\delta I_{R}(t+\tau )\rangle }{\langle I_{G}(t)\rangle \langle I_{R}(t)\rangle }}={\frac {\langle I_{G}(t)I_{R}(t+\tau )\rangle }{\langle I_{G}(t)\rangle \langle I_{R}(t)\rangle }}}$

donde señales fluorescentes diferenciales${\displaystyle \\delta I_{G}}$en un momento específico,${\displaystyle \ t}$y${\displaystyle \ \delta I_{R}}$en un tiempo de retraso,${\displaystyle \ \tau }$Posteriormente, se correlacionan entre sí. En ausencia de solapamiento espectral —cuando la señal de fluorescencia de un canal adyacente es visible en el canal observado—, la función de correlación cruzada es cero para partículas que no interactúan. A diferencia de FCS, la función de correlación cruzada aumenta con el número de partículas que interactúan.

FCCS se utiliza principalmente para estudiar interacciones biomoleculares tanto en células vivas como in vitro. ^{[ 5 ] [ 2 ]} Permite medir estequiometrías moleculares simples y constantes de unión. ^{[ 3 ]} Es una de las pocas técnicas que puede proporcionar información sobre interacciones proteína-proteína en un momento y lugar específicos dentro de una célula viva. A diferencia de la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia , FCCS no tiene un límite de distancia para las interacciones, lo que la hace adecuada para analizar complejos grandes. Sin embargo, FCCS requiere la difusión activa de los complejos a través del foco del microscopio en una escala de tiempo relativamente corta, típicamente segundos.

La función matemática utilizada para modelar las curvas de correlación cruzada en FCCS es ligeramente más compleja en comparación con la utilizada en FCS. Una de las principales diferencias es el volumen de observación superpuesto efectivo, denotado como ${\displaystyle \ V_{eff,RG}}$en el que los canales G y R forman un único volumen de observación:

${\displaystyle \ V_{eff,RG}=\pi ^{3/2}(\omega _{xy,G}^{2}+\omega _{xy,R}^{2})(\omega _{z,G}^{2}+\omega _{z,R}^{2})^{1/2}/2^{3/2}}$

dónde${\displaystyle \ \omega _{xy,G}^{2}}$y${\displaystyle \ \omega _{xy,R}^{2}}$son parámetros radiales y${\displaystyle \ \omega _ {z,G}}$y${\displaystyle \ \omega _ {z,R}}$son los parámetros axiales para los canales G y R respectivamente.

El tiempo de difusión,${\displaystyle \ \tau _{D,GR}}$Por lo tanto, una especie doblemente fluorescente (G y R) se describe de la siguiente manera:

${\displaystyle \ \tau _{D,GR}={\frac {\omega _{xy,G}^{2}+\omega _{xy,R}^{2}}{8D_{GR}}}}$

dónde${\displaystyle \ D_{GR}}$es el coeficiente de difusión de la partícula doblemente fluorescente.

La curva de correlación cruzada generada a partir de partículas fluorescentes doblemente marcadas en difusión se puede modelar en canales separados de la siguiente manera:

${\displaystyle \ G_{G}(\tau )=1+{\frac {(<C_{G}>Diff_{k}(\tau )+<C_{GR}>Diff_{k}(\tau ))}{V_{eff,GR}(<C_{G}>+<C_{GR}>)^{2}}}}$

${\displaystyle \ G_{R}(\tau )=1+{\frac {(<C_{R}>Diff_{k}(\tau )+<C_{GR}>Diff_{k}(\tau ))}{V_{eff,GR}(<C_{R}>+<C_{GR}>)^{2}}}}$

En el caso ideal, la función de correlación cruzada es proporcional a la concentración del complejo fluorescente doblemente marcado:

${\displaystyle \ G_{GR}(\tau )=1+{\frac {<C_{GR}>Diff_{GR}(\tau )}{V_{eff}(<C_{G}>+<C_{GR}>)(<C_{R}>+<C_{GR}>)}}}$

con${\displaystyle \ Diff_{k}(\tau )={\frac {1}{(1+{\frac {\tau }{\tau _{D,i}}})(1+a^{-2}({\frac {\tau }{\tau _{D,i}}})^{1/2}}}}$

La amplitud de la correlación cruzada es directamente proporcional a la concentración de especies doblemente marcadas (rojas y verdes). ^{[ 4 ] [ 6 ]}

La FCCS mide las fluctuaciones coincidentes de intensidad verde y roja de distintas moléculas que se correlacionan si las partículas marcadas con verde y rojo se mueven juntas a través de un volumen confocal predefinido. Para realizar la espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia (FCCS), las muestras de interés se marcan primero con sondas fluorescentes de diferentes colores. El sistema FCCS normalmente incluye un microscopio confocal, dos fuentes láser y dos detectores. El microscopio confocal se utiliza para enfocar los haces láser y recoger las señales de fluorescencia. Las señales de los detectores se recogen y registran a lo largo del tiempo. ^{[ 6 ] [ 7 ]} El análisis de datos implica la correlación cruzada de las señales para determinar el grado de correlación entre las dos sondas fluorescentes. Esta información se puede utilizar para extraer datos sobre la estequiometría y las constantes de unión de los complejos moleculares, así como la sincronización y la ubicación de las interacciones dentro de las células vivas. ^{[ 6 ]}

La espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia (FCCS) tiene varias aplicaciones en el campo de la biofísica y la bioquímica . La espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia (FCCS) es una técnica poderosa que permite investigar las interacciones entre varios tipos de biomoléculas , incluidas proteínas , ácidos nucleicos y lípidos . ^{[ 8 ]}

La FCCS es una de las pocas técnicas que pueden proporcionar información sobre las interacciones proteína-proteína en un momento y lugar específicos dentro de una célula viva. La FCCS se puede utilizar para estudiar la dinámica de las biomoléculas en células vivas, incluyendo sus tasas de difusión y localización. ^{[ 9 ]}

Esto puede proporcionar información sobre la función y la regulación de los procesos celulares. A diferencia de la transferencia de energía por resonancia de Förster , la FCCS no tiene un límite de distancia para las interacciones, lo que la hace adecuada para analizar complejos grandes. Sin embargo, la FCCS requiere la difusión activa de los complejos a través del foco del microscopio en una escala de tiempo relativamente corta, típicamente segundos. La FCCS permite medir estequiometrías moleculares simples y constantes de unión . ^{[ 9 ]}

• coeficiente de difusión
• Dispersión dinámica de la luz
• Espectroscopia de fluorescencia

• Correlación cruzada de fluorescencia (FCCS) (Becker & Hickl GmbH, página web)