Microscopía de forma de decaimiento de intensidad de fluorescencia

Dentro del estudio científico del color de una molécula , la microscopía de forma de decaimiento de intensidad de fluorescencia (FIDSAM) es una técnica de microscopía de fluorescencia que utiliza la evolución temporal de la emisión de fluorescencia después de una excitación pulsada para analizar las estadísticas de decaimiento de un cromóforo excitado . ^{[ 1 ]} La principal aplicación de FIDSAM es la discriminación de la señal de fondo autofluorescente no específica de la señal objetivo de un cromóforo específico.

El método FIDSAM analiza el número de moléculas diferentes que contribuyen a una señal de fluorescencia medida. Suponiendo una solución de colorante fluorescente puro en un entorno isotrópico, los emisores individuales son indistinguibles. Por consiguiente, obedecen a la misma estadística de emisión de fluorescencia y la evolución temporal de la emisión de fluorescencia tras una excitación pulsada puede describirse mediante una función de decaimiento monoexponencial según:

${\displaystyle F(t)=Ae^{-t/\tau }}$

con${\displaystyle A}$= la intensidad de fluorescencia inicial después de la excitación y${\displaystyle \tau }$= la constante de decaimiento (tiempo de vida de la fluorescencia).

En cambio, el fondo autofluorescente consiste en una multitud de emisores individuales, que obedecen a estadísticas de emisión individuales. Por consiguiente, la evolución temporal muestrea una suma de numerosas estadísticas de decaimiento individuales y puede escribirse como:

${\displaystyle F(t)=\sum (A_{1}e^{-t/\tau _{1}})}$.

La técnica FIDSAM se basa en una medición de conteo de fotones individuales correlacionados en el tiempo (TCSPC) y analiza el grado de desviación de una caída de fluorescencia registrada de un comportamiento monoexponencial. Esto se logra ajustando la caída de intensidad de fluorescencia registrada mediante una función de caída monoexponencial convolucionada con la función de respuesta del instrumento. En un paso siguiente, el valor de error del procedimiento de ajuste,${\displaystyle \chi ^{2}}$Se extrae y su valor inverso se multiplica por el valor de intensidad original. De esta manera, la señal de fluorescencia, que se origina a partir del fondo de autofluorescencia y, por lo tanto, presenta valores de error aumentados, se divide por un número relativamente grande, mientras que la señal de fluorescencia de las moléculas objetivo presenta valores de error pequeños cercanos a la unidad, se divide por un número pequeño y permanece prácticamente inalterada.

Por lo general, la técnica FIDSAM se aplica a la microscopía de imagen. Si bien el protocolo de medición es similar al de la microscopía de imagen de tiempo de vida de fluorescencia (FLIM) , el parámetro de lectura es diferente. En FLIM, se obtiene la constante de decaimiento característica , mientras que FIDSAM analiza la forma del decaimiento de la intensidad de fluorescencia mediante el valor de error. Por ello, FIDSAM no depende intrínsecamente de las fluctuaciones del tiempo de vida de fluorescencia, que suelen producirse debido al entorno químico individual de un cromóforo, sino del análisis de la isotropía de los emisores que contribuyen en un volumen de muestra determinado.