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Conversión ascendente de fluorescencia

La conversión ascendente de fluorescencia (FU) es una técnica espectroscópica láser ultrarrápida . Es una variante de la generación de frecuencia suma (de la cual la generación ...

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La conversión ascendente de fluorescencia (FU) es una técnica espectroscópica láser ultrarrápida . Es una variante de la generación de frecuencia suma (de la cual la generación de segundo armónico (SHG) es un caso particular), pero aplicada a la detección de la fluorescencia incoherente . Por lo tanto, está estrechamente relacionada con la técnica de compuerta óptica de Kerr (OKG). La FU se ha convertido en una herramienta ampliamente utilizada en el campo de la femtoquímica , el estudio de reacciones químicas en escalas de tiempo muy cortas.

La conversión ascendente de fluorescencia no debe confundirse con la conversión ascendente de fotones , a veces denominada fluorescencia de conversión ascendente.

Descripción

La conversión ascendente de fluorescencia (FU) es una técnica espectroscópica resuelta en el tiempo que se basa en el uso de pulsos láser ultracortos, típicamente de cien femtosegundos o menos. Es una técnica de bombeo-sonda en la que los dos pulsos están separados en el tiempo por un retardo controlable. La característica más destacada de la FU es que la resolución temporal solo está limitada por la duración del pulso láser, que hoy en día es fácilmente < 100 femtosegundos. Dos revisiones técnicas tempranas, escritas por Jagdeep Shah y Paul Barbara respectivamente, describen la técnica FU en detalle. [ 1 ] [ 2 ] Algunas revisiones más recientes proporcionan información adicional. [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ]

Configuración FU
Esquema simplificado de un sistema de conversión ascendente de fluorescencia.

Brevemente, un pulso de bombeo bastante fuerte excita la muestra, generando la fluorescencia (a una frecuencia ν F ) que se recoge y enfoca en un cristal óptico no lineal . Paralelamente, un pulso de sonda intenso (también llamado pulso de puerta, a una frecuencia ν G ) se enfoca y se superpone con la fluorescencia en el cristal. La interacción instantánea de la fluorescencia y el pulso de sonda en el cristal permite la generación de luz de frecuencia suma a una frecuencia ν S = ν G + ν F (donde ν es la frecuencia). [ 1 ] Es importante que la fluorescencia y los pulsos de sonda lleguen simultáneamente (o casi) al cristal; para este propósito, el pulso de sonda se dirige a través de una etapa de retardo óptico controlable .

En pocas palabras, el pulso de sonda (compuerta) representa una "ventana de tiempo" durante la cual se detecta la fluorescencia. Una ventaja importante de esta técnica es que la intensidad de la señal detectada (la luz de frecuencia suma) es directamente proporcional a la intensidad de la fluorescencia. [ 6 ] Dado que la luz de frecuencia suma aparece en longitudes de onda más cortas que la fluorescencia, se puede utilizar un monocromador o un filtro óptico para suprimir tanto la fluorescencia como la luz láser difusa, lo que permite una alta relación señal-ruido cuando se detecta, por ejemplo, mediante un fotomultiplicador. [ 1 ]

Historia

La primera demostración de la técnica FU fue reportada por Mahr y Hirsch en 1975. [ 7 ] Utilizaron FU para comparar los perfiles temporales de los pulsos láser verdes generados por un láser de argón de modo bloqueado con los pulsos láser rojos emitidos por un láser de colorante Rodamina 6G. En este último caso encontraron un componente de vida mucho más larga (varios nanosegundos), asignado a la emisión espontánea (fluorescencia). Poco después, Hirsch y colaboradores utilizaron la técnica FU para estudiar la fotoquímica de la bacteriorrodopsina. [ 8 ] Midieron la vida media de emisión de la bacteriorrodopsina a temperaturas fisiológicas, obteniendo un valor de 15 ± 3 ps.

Entre las primeras aplicaciones de la FU con resolución temporal de subpicosegundos se encontraba el estudio de los efectos dinámicos del disolvente . Este tema se conoce generalmente como dinámica de solvatación . En resumen, la dinámica de solvatación se puede estudiar siguiendo la evolución temporal del espectro de fluorescencia de una molécula sonda fluorescente "inerte" en solución. Esto proporciona el desplazamiento de Stokes de fluorescencia dependiente del tiempo (TDFSS).

Hallidy y Topp fueron los primeros en estudiar la dinámica de solvatación utilizando FU. Caracterizaron la dependencia de la temperatura de la evolución del espectro de fluorescencia en términos de dos procesos de relajación independientes: la dinámica de solvatación y la extinción de fluorescencia asistida por el disolvente. [ 9 ]

Graham Fleming y colaboradores también estudiaron la dinámica de solvatación en diversos disolventes de baja viscosidad a temperatura ambiente utilizando FU. Distinguieron varios procesos de solvatación, desde procesos de difusión de largo alcance más lentos hasta efectos inerciales ultrarrápidos en la primera capa de solvatación. [ 10 ] [ 11 ]

Otro posible origen del desplazamiento de Stokes observado en moléculas poliatómicas es la relajación vibracional intramolecular que fue caracterizada utilizando FU notablemente por el grupo de Wolfgang Kaiser . [ 6 ] [ 12 ]

El grupo de Paul Barbara utilizó FU para estudiar no solo la dinámica de solvatación y la relajación vibracional , sino también la transferencia intramolecular de protones en estado excitado en varias moléculas orgánicas. [ 13 ]

Actualmente, el número de artículos que utilizan FU, según la base de datos Web of Science (agosto de 2025), supera los 1200, pero sin duda se trata de una subestimación.

Registros cinéticos y espectrales

La aplicación más directa de la conversión ascendente de fluorescencia consiste en analizar el retardo óptico (véase más arriba) entre la fluorescencia (es decir, el pulso de excitación) y el pulso de activación para configuraciones fijas del cristal, etc. Esto proporciona trazas cinéticas de la intensidad de fluorescencia a una longitud de onda determinada. Sin embargo, resulta más interesante monitorizar la evolución temporal del espectro de fluorescencia completo, lo cual es difícil dado que la técnica FU tiene un ancho de banda espectral muy limitado (<10 nm). Para superar este problema, se pueden utilizar diversos enfoques.

El método más utilizado consiste en reconstruir el espectro de fluorescencia resuelto en el tiempo a posteriori a partir de una serie de trazas cinéticas individuales registradas en diferentes longitudes de onda. [ 14 ]

Alternativamente, se puede realizar un escaneo por pasos, donde, para un retardo dado, el monocromador se escanea en longitud de onda mientras se optimiza el ángulo de adaptación de fase. [ 15 ]

En principio, se puede obtener una detección de banda ancha real de la señal de conversión ascendente con un espectrógrafo equipado con una cámara CCD. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, el ancho de banda limitado del cristal no permite cubrir todo el espectro de fluorescencia. Una solución elegante para superar este problema consiste en rotar rápidamente el cristal durante el tiempo de medición. [ 16 ] [ 17 ]

Ernsting y colaboradores desarrollaron un enfoque mucho más avanzado, ajustando la dispersión angular dependiente de la longitud de onda de la fluorescencia focalizada para cumplir las condiciones de coincidencia de fase en un amplio rango espectral. [ 18 ]

Referencias

  1. 1 2 3 Shah, J. (1988). "Espectroscopia de luminiscencia ultrarrápida mediante generación de frecuencia suma". IEEE Journal of Quantum Electronics . 24 (2): 276– 288. Bibcode : 1988IJQE...24..276S . doi : 10.1109/3.124 .
  2. ↑ Kahlow, MA; Jarzeba, W.; DuBruil, TP; Barbara, PF (1988). "Espectroscopia de emisión ultrarrápida en el ultravioleta mediante conversión ascendente con compuerta temporal" . Review of Scientific Instruments . 59 (7): 1098– 1109. Bibcode : 1988RScI...59.1098K . doi : 10.1063/1.1139734 .
  3. ↑ Mialocq, J.-C.; Gustavsson, T. (2001). "Investigación de la reactividad química de femtosegundos mediante conversión ascendente de fluorescencia" . En Valeur, B.; Brochon, J.-C. (eds.). Nuevas tendencias en espectroscopia de fluorescencia . Serie Springer sobre fluorescencia. Vol. 1. Springer. pp. 61–80 . doi : 10.1007/978-3-642-56853-4_4 . ISBN   978-3-642-63214-3.
  4. ↑ Lemmetyinen, H.; Tkachenko, NV; Valeur, B.; Hotta, J.-I.; Ameloot, M.; Ernsting, NP; Gustavsson, T.; Boens, T. (2014). "Métodos de fluorescencia resuelta en el tiempo" . Pure Appl. Chem . 86 (12): 1969– 1998. doi : 10.1515/pac-2013-0912 .
  5. ↑ Chosrowjan, H.; Taniguchi, S.; Tanaka, F. (2015). "Técnica de conversión ascendente de fluorescencia ultrarrápida y sus aplicaciones a las proteínas". The FEBS Journal . 282 (16): 3003– 3015. doi : 10.1111/febs.13180 . PMID 25532707 . 
  6. 1 2 Kopainsky, B; Kaiser, W (1978). "Investigación de procesos de transferencia intra e intermolecular mediante compuertas de fluorescencia de picosegundos". Optics Communications . 26 (2): 219– 224. Bibcode : 1978OptCo..26..219K . doi : 10.1016/0030-4018(78)90057-3 .
  7. ↑ Mahr, H.; Hirsch, MD (1975). "Una puerta de luz de conversión ascendente óptica con resolución de picosegundos". Optics Comm . 13 (2): 96– 99. Bibcode : 1975OptCo..13...96M . doi : 10.1016/0030-4018(75)90017-6 .
  8. ↑ Hirsch, M.; Marcus, MA; Lewis, A.; Mahr, H.; Frigo, N. (1976). "Un método para medir fenómenos de picosegundos en especies fotolábiles" ( PDF) . Biophysical Journal . 16 (12): 1399– 1409. doi : 10.1016/S0006-3495(76)85783-9 . PMC 1334971. PMID 990393 .  
  9. ↑ Hallidy, LA; Topp, MR (1977). "Resolución temporal directa del desplazamiento de fluorescencia de Stokes de una molécula polar en un disolvente polar". Chem. Phys. Lett . 48 (1): 40– 50. Bibcode : 1977CPL....48...40H . doi : 10.1016/0009-2614(77)80209-1 .
  10. ↑ Castner Jr., EW; Maroncelli, M.; Fleming, GR (1987). "Estudios de resolución subpicosegundo de la dinámica de solvatación en disolventes apróticos y alcohólicos polares". J. Chem. Phys . 86 (3): 1090– 1097. Bibcode : 1987JChPh..86.1090C . doi : 10.1063/1.452249 .
  11. ↑ Jiménez, R.; Fleming, GR; Kumar, PV; Maroncelli, M. (1994). "Dinámica de solvatación del agua en femtosegundos". Nature . 369 (6480): 471– 473. Bibcode : 1994Natur.369..471J . doi : 10.1038/369471a0 .
  12. ↑ Kopainsky, B.; Kaiser, W. (1978). "Investigación de procesos de transferencia intra e intermolecular mediante compuertas de fluorescencia de picosegundos". Optics Comm . 26 (2): 219– 224. Bibcode : 1978OptCo..26..219K . doi : 10.1016/0030-4018(78)90057-3 .
  13. ↑ Ding, K.; Courtney, SJ; Strandjord, AJ; Flom, S.; Friedrich, D.; Barbara, PF (1983). "Transferencia intramolecular de protones en estado excitado y relajación vibracional en 2-(2-hidroxifenil)benzotiazol". J. Phys. Chem . 87 (7): 1184– 1188. doi : 10.1021/j100230a018 .
  14. ↑ Maroncelli, M.; Fleming, GR (1987). "Dinámica de solvatación de picosegundos de la cumarina 153: la importancia de los aspectos moleculares de la solvatación". J. Chem. Phys . 86 (11): 6221– 6239. Bibcode : 1987JChPh..86.6221M . doi : 10.1063/1.452460 .
  15. ↑ Gustavsson, T.; Cassara, L.; Gulbinas, V.; Gurzadyan, G.; Mialocq, J.-C.; Pommeret, S.; Sorgius, M.; van der Meulen, P. (1998). "Estudio espectroscópico de femtosegundos de los procesos de relajación de tres colorantes de cumarina sustituidos con amino en metanol y dimetilsulfóxido". J. Phys. Chem. A . 102 (23): 4229– ​​4245. Bibcode : 1998JPCA..102.4229G . doi : 10.1021/jp980282d .
  16. ↑ Haacke, S.; Taylor, RA; Bar-Joseph, I.; Brasil, MJSP; Hartig, M.; Deveau, B. (1998). "Mejora de la relación señal-ruido de la conversión ascendente de luminiscencia de femtosegundos mediante detección multicanal" . Journal of the American Optical Society B. 15 ( 4): 1410– 1417. Bibcode : 1998JOSAB..15.1410H . doi : 10.1364/JOSAB.15.001410 .
  17. ↑ Cannizzo, A.; Bräm, O.; Zgrablic, G.; Tortschanoff, A.; Ajdarzadeh Oskouei, A.; van Mourik, F.; Chergui, M. (2007). "Configuración de conversión ascendente de fluorescencia de femtosegundos con detección de banda ancha en el ultravioleta" . Optics Letters . 12 (24): 3555– 3557. Bibcode : 2007OptL...32.3555C . doi : 10.1364/OL.32.003555 . PMID 18087540 . 
  18. ↑ Zhang, XX; Wurth, C.; Zhao, L.; Resch-Genger, U.; Ernsting, NP; Sajadi, M. (2011). "Espectroscopia de conversión ascendente de fluorescencia de banda ancha de femtosegundos: configuración mejorada y corrección fotométrica" . Rev. Sci. Instrum . 82 (6): 063108–063108–8. Bibcode : 2011RScI...82f3108Z . doi : 10.1063/1.3597674 . PMID 21721675 .