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Un fluorímetro es un dispositivo que se utiliza para medir parámetros de fluorescencia en el espectro visible : su intensidad y distribución de longitud de onda del espectro de emisión tras la excitación con un determinado espectro de luz . [ 1 ] Estos parámetros se utilizan para identificar la presencia y la cantidad de moléculas específicas en un medio. Los fluorímetros modernos son capaces de detectar concentraciones de moléculas fluorescentes tan bajas como 1 parte por billón.
El análisis de fluorescencia puede ser mucho más sensible que otras técnicas. Sus aplicaciones incluyen química / bioquímica , medicina y monitoreo ambiental . Por ejemplo, se utiliza para medir la fluorescencia de la clorofila e investigar la fisiología vegetal .
Componentes y diseño
Los fluorómetros suelen utilizar un doble haz. Estos dos haces trabajan conjuntamente para reducir el ruido generado por las fluctuaciones de la potencia radiante. El haz superior pasa a través de un filtro o monocromador e incide sobre la muestra. El haz inferior pasa a través de un atenuador y se ajusta para intentar igualar la potencia de fluorescencia emitida por la muestra. La luz proveniente de la fluorescencia de la muestra y del haz inferior atenuado es detectada por transductores independientes y convertida en una señal eléctrica que es interpretada por un sistema informático.
Dentro del aparato, el transductor que detecta la fluorescencia generada por el haz superior se encuentra a cierta distancia de la muestra y formando un ángulo de 90 grados con el haz superior incidente. El aparato está diseñado de esta manera para reducir la luz parásita del haz superior que podría incidir sobre el detector. El ángulo óptimo es de 90 grados. Existen dos enfoques diferentes para la selección de la luz incidente, lo que da lugar a distintos tipos de fluorómetros. Si se utilizan filtros para seleccionar las longitudes de onda de la luz, el aparato se denomina fluorómetro. Si bien un espectrofluorómetro suele utilizar dos monocromadores, algunos pueden emplear un filtro y un monocromador. En este caso, el filtro de banda ancha reduce la luz parásita, incluyendo la proveniente de órdenes de difracción no deseados de la red de difracción del monocromador.
Las fuentes de luz para fluorómetros suelen depender del tipo de muestra que se analiza. Entre las fuentes de luz más comunes para fluorómetros se encuentra la lámpara de mercurio de baja presión . Esta proporciona numerosas longitudes de onda de excitación, lo que la convierte en la más versátil. Sin embargo, esta lámpara no es una fuente de radiación continua. La lámpara de arco de xenón se utiliza cuando se necesita una fuente de radiación continua. Ambas fuentes proporcionan un espectro adecuado de luz ultravioleta que induce quimioluminiscencia . Estas son solo dos de las muchas fuentes de luz posibles. [ 2 ]
Las cubetas de vidrio y sílice suelen ser los recipientes donde se coloca la muestra. Es importante tener cuidado de no dejar huellas dactilares ni ninguna otra marca en la superficie exterior de la cubeta, ya que esto puede producir fluorescencia no deseada. En ocasiones, se utilizan disolventes de grado espectroscópico, como el metanol, para limpiar las superficies de los recipientes y minimizar estos problemas.
Usos
Industria láctea
La fluorimetría es ampliamente utilizada por la industria láctea para verificar si la pasteurización ha sido exitosa. Esto se realiza mediante un reactivo que se hidroliza a un fluoróforo y ácido fosfórico por acción de la fosfatasa alcalina presente en la leche. [ 3 ] Si la pasteurización ha sido exitosa, la fosfatasa alcalina se desnaturalizará por completo y la muestra no presentará fluorescencia. Esto se debe a que los patógenos presentes en la leche mueren con cualquier tratamiento térmico que desnaturalice la fosfatasa alcalina. [ 4 ] [ 5 ]
Los productores de leche en el Reino Unido necesitan ensayos de fluorescencia para demostrar que la pasteurización se ha realizado correctamente, [ 6 ] por lo que todas las lecherías del Reino Unido cuentan con equipos de fluorimetría.
Agregación de proteínas y detección de EET
Las tioflavinas son colorantes que se utilizan para la tinción histológica y los estudios biofísicos de la agregación de proteínas. [ 7 ] Por ejemplo, la tioflavina T se utiliza en la técnica RT-QuIC para detectar priones mal plegados que causan encefalopatía espongiforme transmisible .
Oceanografía
Los fluorómetros se utilizan ampliamente en oceanografía para medir las concentraciones de clorofila basándose en la fluorescencia de la clorofila producida por los pigmentos de las células del fitoplancton . La fluorescencia de la clorofila es un indicador ampliamente utilizado de la cantidad (biomasa) de algas microscópicas en el agua. En el laboratorio, después de tomar muestras de agua, los investigadores extraen los pigmentos de un filtro que contiene células de fitoplancton y luego miden la fluorescencia del extracto en un fluorómetro de sobremesa en una habitación oscura. [ 8 ] Para medir directamente la fluorescencia de la clorofila "in situ" (en el agua), los investigadores utilizan instrumentos diseñados para medir la fluorescencia ópticamente (por ejemplo, sondas con sensores ópticos electrónicos adicionales). Los sensores ópticos emiten luz azul para excitar los pigmentos del fitoplancton y hacer que fluorescan o emitan luz roja. El sensor mide esta fluorescencia inducida midiendo la luz roja como un voltaje, y el instrumento la guarda en un archivo de datos. La señal de voltaje del sensor se convierte en una concentración con una curva de calibración en el laboratorio, utilizando colorantes de color rojo como la rodamina , estándares como la fluoresceína o cultivos vivos de fitoplancton . [ 9 ]
La fluorescencia de la clorofila oceánica se mide en buques de investigación, pequeñas embarcaciones, boyas, muelles y embarcaderos en todo el mundo. Las mediciones de fluorometría se utilizan para mapear las concentraciones de clorofila en apoyo de la teledetección del color del océano . Los fluorómetros especiales para aguas oceánicas pueden medir propiedades más allá de la cantidad total de fluorescencia, como el rendimiento cuántico de la fotoquímica , el momento de la fluorescencia y la fluorescencia de las células cuando se exponen a cantidades crecientes de luz. [ 10 ] Las operaciones de acuicultura, como las piscifactorías, utilizan fluorómetros para medir la disponibilidad de alimento para animales filtradores como los mejillones [ 11 ] y para detectar el inicio de floraciones de algas nocivas (FAN) y/o " mareas rojas " (que no necesariamente son lo mismo). [ 12 ]
Biología molecular
Los fluorómetros se pueden utilizar para determinar la concentración de ácido nucleico en una muestra. [ 13 ]
Tipos de fluorómetros
Existen dos tipos básicos de fluorómetros: los fluorómetros de filtro y los espectrofluorómetros. La diferencia radica en la forma en que seleccionan las longitudes de onda de la luz incidente; los fluorómetros de filtro utilizan filtros, mientras que los espectrofluorómetros emplean monocromadores de rejilla. Los fluorómetros de filtro suelen ser más económicos, ya sea mediante compra o fabricación, pero son menos sensibles y tienen menor resolución que los espectrofluorómetros. Además, los fluorómetros de filtro solo pueden operar en las longitudes de onda de los filtros disponibles, mientras que los monocromadores generalmente permiten un ajuste libre en un rango relativamente amplio. La desventaja potencial de los monocromadores reside precisamente en esta característica, ya que pueden descalibrarse o desajustarse, mientras que la longitud de onda de los filtros es fija desde su fabricación.
Véase también
- Espectroscopia de fluorescencia , para una descripción más completa de la instrumentación.
- Fluorescencia de la clorofila , para investigar la ecofisiología de las plantas.
- Fluorómetro integrado para medir el intercambio de gases y la fluorescencia de la clorofila en las hojas.
- Radiómetro , para medir diversas radiaciones electromagnéticas.
- Espectrómetro , para analizar el espectro de radiación electromagnética.
- Dispersómetro , para medir la radiación dispersa.
- Microfluorimetría , para medir la fluorescencia a nivel microscópico.
- Filtro de interferencia , filtros de película delgada que funcionan por interferencia óptica, mostrando cómo se pueden ajustar en algunos casos.
Referencias
- ↑ "Espectrofotometría de fluorescencia" . Enciclopedia de Ciencias de la Vida . Macmillan Publishers Ltd. 2002. Archivado del original el 14 de mayo de 2014. Consultado el 9 de septiembre de 2017 .
- ↑ Scientifica (2025). "Cómo elegir la mejor fuente de luz para tu experimento de fluorescencia" . Scientifica .
- ↑ Langridge, E W. La determinación de la actividad de la fosfatasa . Quality Management Ltd. Recuperado el 20 de diciembre de 2013 .
- ↑ Kay, H. (1935). "Algunos resultados de la aplicación de una prueba simple para la eficiencia de la pasteurización". The Lancet . 225 (5835): 1516– 1518. doi : 10.1016/S0140-6736(01)12532-8 .
- ↑ Hoy, WA; Neave, FK (1937). "La prueba de la fosfatasa para una pasteurización eficiente". The Lancet . 230 (5949): 595. doi : 10.1016/S0140-6736(00)83378-4 .
- ↑ BS EN ISO 11816-1:2013
- ↑ Biancalana M, Koide S (julio de 2010). "Mecanismo molecular de la unión de tioflavina-T a las fibrillas amiloides" . Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics . 1804 (7): 1405–12 . doi : 10.1016/j.bbapap.2010.04.001 . PMC 2880406. PMID 20399286 .
- ↑ Holm-Hansen, Osmund; Lorenzen, Carl J.; Holmes, Robert W.; Strickland, John DH (1965). "Determinación fluorométrica de la clorofila". ICES Journal of Marine Science . 30 (1): 3– 15. doi : 10.1093/icesjms/30.1.3 .
- ↑ Earp, Alan (2011). "Revisión de estándares fluorescentes para la calibración de fluorómetros in situ: Recomendaciones aplicadas en programas de observación costera y oceánica". Optics Express . 19 (27): 26768– 26782. Bibcode : 2011OExpr..1926768E . doi : 10.1364/OE.19.026768 . hdl : 10453/18163 . PMID 22274260 .
- ↑ Falkowski, Paul G.; Lin, Hanzhi; Gorbunov, Maxim Y. (14 de agosto de 2017). "¿Qué limita la eficiencia de conversión de energía fotosintética en la naturaleza? Lecciones de los océanos" . Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences . 372 (1730) 20160376. The Royal Society. doi : 10.1098/rstb.2016.0376 . ISSN 0962-8436 . PMC 5566876. PMID 28808095 .
- ↑ Ogilvie, Shaun C.; Ross, Alex H.; Schiel, David R. (2000). "Biomasa de fitoplancton asociada a granjas de mejillones en Beatrix Bay, Nueva Zelanda". Aquaculture . 181 ( 1– 2): 71– 80. Bibcode : 2000Aquac.181...71O . doi : 10.1016/S0044-8486(99)00219-7 .
- ↑ Anderson, Donald M.; Anderson, Per; Bricelj, V. Monica; Cullen, John J.; Rensel, JE Jack (2001). Estrategias de monitoreo y gestión de floraciones de algas nocivas en aguas costeras, APEC #201-MR-01.1 (PDF) . París: Programa Económico de Asia Pacífico, Singapur, y Serie Técnica No. 59 de la Comisión Oceanográfica Intergubernamental.
- ↑ Mészáros, Éva (2021). "Determinar la concentración y pureza de los ácidos nucleicos" . INTEGRA Biosciences .
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