microscopía de espectro de fuerza

La microscopía de espectro de fuerza (FSM) es una aplicación de la microrreología activa desarrollada para medir fuerzas aleatorias agregadas en el citoplasma . ^{[ 1 ]} Se inyectan trazadores de flujo grandes e inertes en células vivas y se alojan dentro de la malla del citoesqueleto , donde oscilan por repercusiones de proteínas motoras activas. La magnitud de estas fuerzas aleatorias se puede inferir a partir de la frecuencia de oscilación de las partículas trazadoras. El seguimiento de las fluctuaciones de las partículas trazadoras mediante microscopía óptica permite aislar la contribución de las fuerzas aleatorias activas al transporte molecular intracelular de la del movimiento browniano .

FSM fue desarrollado por Ming Guo y David A. Weitz para investigar las fuerzas intracelulares estocásticas generadas por las proteínas motoras. ^{[ 1 ]} Lejos de ser un vacío líquido, el citoplasma contiene una compleja red de actina y miosina que confiere soporte estructural a la célula, además de albergar vesículas y mitocondrias, entre otros orgánulos. ^{[ 2 ]} Investigaciones recientes sobre el hacinamiento macromolecular dentro del citoplasma plantean dudas sobre si el movimiento de tipo difusivo de las moléculas grandes se ha atribuido erróneamente a las fuerzas brownianas. ^{[ 3 ]} En cambio, se sospecha que las proteínas motoras de miosina , que tiran aleatoriamente de los filamentos de actina incrustados con moléculas grandes, dan lugar a un movimiento de tipo difusivo de las moléculas dentro de las células. ^{[ 3 ] [ 4 ]} Guo et al. desarrollaron un ensayo para distinguir si el movimiento de partículas dentro de las células es impulsado por difusión térmica o por repercusiones de proteínas motoras activas como la miosina II no muscular que sacude el citoesqueleto celular.

La FSM se basa en la inyección de partículas trazadoras recubiertas con polietilenglicol (PEG) de mayor tamaño que la malla del citoesqueleto (>50  nm), ^{[ 5 ]} que se asientan entre una red de filamentos de actina y proteínas motoras de miosina. A medida que las proteínas motoras de miosina tiran de los filamentos de actina para realizar trabajo celular, estas fluctuaciones de actina invariablemente hacen oscilar las partículas PEGiladas vecinas. La magnitud de la fluctuación de la trazadora es proporcional a la magnitud de las fuerzas motoras activas agregadas. Por lo tanto, al registrar el desplazamiento de las oscilaciones de la trazadora, la FSM puede medir y derivar la magnitud de las fuerzas ejercidas por las proteínas motoras activas. ^{[ 1 ]}

Las fluctuaciones de los trazadores PEGilados acoplados a las fuerzas motoras de la miosina agregada pueden compararse con un resorte hookeano ,

${\displaystyle F=kx}$

donde la fuerza${\displaystyle F}$aplicado para generar el desplazamiento de oscilación${\displaystyle x}$es proporcional a la constante elástica efectiva${\displaystyle k}$del entorno intracelular. El desplazamiento durante la oscilación es una función espacial del tiempo, que puede medirse directamente mediante microscopía óptica. ^{[ 1 ]} Una transformada de Fourier luego mapea la información en el dominio temporal al dominio de la frecuencia para derivar una dimensión útil en función de la frecuencia,

${\displaystyle \langle \left(F(v)\right)^{2}\rangle =\langle \left(K(v)\right)^{2}\rangle *\langle \left(x(v)\right)^{2}\rangle }$

dónde${\displaystyle \langle \left(F(v)\right)^{2}\rangle }$,${\displaystyle \langle \left(K(v)\right)^{2}\rangle }$y${\displaystyle \langle \left(x(v)\right)^{2}\rangle }$son formas cuadráticas de fuerza, elasticidad y desplazamiento promedio utilizadas para tener en cuenta las fuerzas estocásticas. ^{[ 1 ]} Desplazamiento cuadrático medio promediado en el tiempo ,${\displaystyle MSD=\langle \left(X(t)\right)^{2}\rangle }$puede recuperarse mediante una transformada de Fourier del dominio de la frecuencia al dominio temporal. En el contexto de la frecuencia de oscilación, cuanto mayor sea el espectro de frecuencia de la fuerza, mayor será la actividad metabólica de la célula. ^{[ 6 ]} Las mediciones micromecánicas independientes pueden calcular la elasticidad del citoplasma. Al utilizar una pinza óptica para aplicar una fuerza prescrita a una partícula trazadora, FSM puede medir el desplazamiento resultante para estimar la constante elástica del resorte. ^{[ 7 ] [ 8 ]}