G6B

La proteína G6b es una proteína que en humanos está codificada por el gen G6B o C6orf25 . ^{[ 5 ] [ 6 ] [ 7 ]}

Este gen pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas (Ig) y se localiza en la región del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) de clase III, una región que contiene numerosos genes relevantes para el sistema inmunitario . ^{[ 8 ]} La proteína codificada por este gen es un receptor de superficie celular glicosilado, unido a la membrana plasmática, pero se han encontrado isoformas solubles codificadas por algunas variantes de transcripción en el retículo endoplasmático y el aparato de Golgi antes de su secreción. Se han identificado múltiples variantes de transcripción que codifican diferentes isoformas para este gen. ^{[ 7 ]}

Las versiones estructuralmente distintas, pero funcionalmente similares, de una proteína que provienen del mismo gen o están muy relacionadas se conocen como isoformas de proteínas o variantes de proteínas. Muchas funcionan de manera similar o biológicamente parecida, pero algunas isoformas tienen funciones únicas. ^{[ 9 ]}

G6b-B es una de las dos isoformas principales unidas a la membrana, que contiene un dominio N-terminal extracelular similar a Ig y un segmento transmembrana. ^{[ 10 ]} Esta isoforma contiene dos motivos inhibidores basados ​​en tirosina de inmunorreceptores (ITIM) en la cola citoplasmática que no se encuentran en la isoforma G6b-A. La isoforma G6b-A se diferencia de la isoforma G6b-B por la cola citoplasmática que no se encuentra en G6b-A. G6b-B se une a las proteínas tirosina fosfatasas SHP-1 y SHP-2 cuando ocurre la fosforilación de los ITIM inducida por pervanadato. Lo que permite la interacción entre G6b con SHP-1 y SHP-2 es la fosforilación de la tirosina 211 que se puede observar en la cola citoplasmática. ^{[ 9 ]}

G6b-B contiene dos residuos de tirosina en la cola citoplasmática (Tyr-211 y Tyr-237) que, mediante mutagénesis dirigida, sugieren que solo Tyr-211 se fosforila cuando se produce la estimulación con pervanadato en células COS-7 . ^{[ 6 ]} Este Tyr-211 es responsable de la unión a SHP-1 y SHP-2. ^{[ 6 ]} La fosforilación de Tyr-237 de la cola citoplasmática de G5b-B no es detectable, ya que existe la posibilidad de que la fosforilación de Tyr-237 dependa de la fosforilación previa de Tyr-211. ^{[ 6 ]}

La función de G6b es la de un receptor de superficie celular con función inhibitoria que opera de manera independiente del calcio. ^{[ 10 ]} Se ha observado que G6b también posee un nuevo receptor inhibitorio que se encuentra en la superficie de las plaquetas. ^{[ 10 ]} La función de G6b tiene una conexión crucial con la identificación del ligando extracelular, ya que los ligandos proteicos para los miembros de la superfamilia Ig son típicamente, aunque no siempre, otros miembros de la superfamilia Ig. ^{[ 11 ]} Las interacciones entre los miembros de la superfamilia Ig y los ligandos conectados a ellos, generalmente tienen una baja afinidad, lo que dificulta la identificación de ligandos en experimentos. ^{[ 11 ]} Por el momento, se ha demostrado que el dominio Ig de G6b no contiene ninguna homología significativa con ningún otro dominio Ig que contenga proteínas con un ligando conocido. ^{[ 6 ]} El dominio extracelular de la proteína G6b muestra que hay evidencia de que la unión a la heparina es principalmente electrostática. ^{[ 11 ]} Sin embargo, el ligando proteico de la parte extracelular de G6b aún no se ha identificado, existe la posibilidad de que la unión de heparina juegue un papel esencial en la función biológica de G6b. ^{[ 11 ]}

La función inhibitoria que se observa se expresa en la superficie de las plaquetas en reposo con reticulación de G6b, lo que conduce al efecto inhibitorio sobre la agregación y activación plaquetaria. ^{[ 10 ]} La agregación plaquetaria estudiada con la reticulación de G6b para determinar si la señalización a través de G6b tenía un efecto sobre la función plaquetaria. ^{[ 10 ]} La reticulación de G6b antes de la activación de las plaquetas con el agonista ADP condujo a una reducción significativa dependiente de la dosis en la agregación plaquetaria, lo que llevó a que la agregación final se redujera del 100% al 25%. ^{[ 10 ]} Asimismo, la reticulación de G6b antes de la activación de CRP-XL condujo a una reducción de dos veces en la agregación plaquetaria. ^{[ 10 ]}

Se ha demostrado que la expresión de G6b-A y G6b-B se expresa en la superficie de las plaquetas de ARN y ARNm en reposo. ^{[ 10 ]} G6b-B es la única isoforma de G6b que, al ser analizada, parece estar fosforilada de manera eficiente cuando las células COS-7 y K562 expresan proteína recombinante tratada con pervanadato. ^{[ 8 ]} Las proteínas se expresan transitoriamente en las células COS-7 mediante el método de DEAE-dextrano. ^{[ 8 ]} Tres días después de la transfección, se recolectan las células y los sobrenadantes. Luego, las células K562 se transfectan con Lipofectina y se mantienen en presencia de 0,5 mg/ml de G418. ^{[ 8 ]}

Las expresiones observadas en células COS-7 de las isoformas G6b provienen de los segmentos transmembrana de G6b-A y G6b-B, así como de las solubles G6b-D y G6b-E. ^{[ 8 ]} G6b-A y G6b-D son idénticas desde su extremo C , opuesto al extremo N y el final de la cadena de aminoácidos. ^{[ 8 ]} Las isoformas G6b correspondientes al extremo C son G6b-A y G6b-E. G6b-A, G6b-B, G6b-D y G6b-E se clonaron en pcDNA3, en combinación con el epítopo T7 como una fusión que da lugar a proteínas de fusión. ^{[ 8 ]} Las nuevas proteínas de fusión en las células COS-7 se expresan transitoriamente. ^{[ 8 ]} Mediante la observación del gel de SDS-poliacrilamida, se observaron múltiples bandas por carril que podrían ser representativas de la glicosilación. ^{[ 8 ]} A partir de esto, cada banda puede representar la glicosilación en diferentes estados en la proteína. ^{[ 8 ]} Las únicas isoformas presentes en el medio fueron G6b-D y G6b-E, ya que no contenían un segmento transmembrana. ^{[ 8 ]} Los tamaños moleculares observados de las proteínas se consideran aceptables con respecto a los tamaños moleculares esperados para cada caso de la banda más baja encontrada en el caso. ^{[ 8 ]} La única excepción fue G6b-E que se encontró en el medio. La presencia de cadenas de glicanos grandes puede ser la causa de esta excepción. ^{[ 8 ]}

Se realizan investigaciones de variantes de G6b para ver si las diferentes variantes de G6b se habían glicosilado, lo cual se hizo a través de la incubación de lisados ​​de células COS-7, los sobrenadantes celulares que contenían las formas C-terminales de G6b en combinación con las glicosidasas N-glicosidasa F, O-glicosidasa y, a veces, neuraminidasa. ^{[ 8 ]} Todas las variantes, con excepción de G6b-E, con el tratamiento con N-glicosidasa F conducen a la desaparición de bandas específicas, lo que lleva a la indicación de cadenas de N-glicanos. ^{[ 8 ]} Los tratamientos con neuraminidasa y O-glicosidasa juntos conducen a un resultado de bandas con peso molecular que no tienen diferencia con las bandas que se obtuvieron después de solo tratamientos con neuraminidasa, con la excepción de G6b-E. ^{[ 8 ]} Esto indica que la O-glicosilación sustancial en la forma. Cuando G6b-A y G6b-B se tratan con N-glicosidasa F y luego se comparan con las proteínas tratadas con las tres glicosidasas, se puede observar una pequeña diferencia en el peso molecular. ^{[ 8 ]} Esta pequeña diferencia se debe a la presencia de cadenas de O-glicano de bajo peso molecular. ^{[ 8 ]} G6b-D y G6b-E secretadas al medio contendrán más glicosilación que la encontrada en los lisados ​​celulares correspondientes. ^{[ 8 ]} Las proteínas que se descubren en los lisados ​​celulares también pueden representar proteínas mal plegadas. ^{[ 8 ]} Esto es la causa de que no se transporten a través de su vía secretora y conduzcan a una glicosilación incompleta. ^{[ 8 ]}