GUÍA-Secuencia

GUIDE-Seq ( Identificación imparcial de roturas de doble cadena en todo el genoma mediante secuenciación ) es una técnica de biología molecular que permite la detección in vitro imparcial de eventos de edición genómica fuera de objetivo en el ADN causados ​​por CRISPR/Cas9 y otras nucleasas guiadas por ARN en células vivas. ^{[ 1 ]} Similar a LAM-PCR, emplea múltiples PCR para amplificar regiones de interés que contienen un inserto específico que se integra preferentemente en roturas de doble cadena. Dado que la terapia génica es un campo emergente, GUIDE-Seq ha ganado popularidad como un método económico para detectar los efectos fuera de objetivo de posibles terapias sin necesidad de secuenciar el genoma completo .

Diseñado para funcionar en conjunto con plataformas de secuenciación de próxima generación como la secuenciación de tintes Illumina , GUIDE-Seq se basa en la integración de un oligodesoxinucleótido bicatenario romo (dsODN) que ha sido fosfotioado en dos de los enlaces fosfato en el extremo 5' de ambas hebras. ^{[ 1 ]} El casete dsODN se integra en cualquier sitio del genoma que contenga una rotura de doble cadena (DSB). ^{[ 1 ]} Esto significa que, además de los sitios objetivo y fuera de objetivo que puedan existir como resultado de la actividad de una nucleasa, el casete dsODN también se integrará en cualquier sitio espurio del genoma que tenga una DSB. ^{[ 1 ]} Por lo tanto, es fundamental contar con una condición de solo dsODN que controle las DSB erróneas y las que ocurren naturalmente, y que sea necesaria para utilizar el flujo de trabajo bioinformático de GUIDE-seq. ^{[ 1 ]}

Tras la integración del casete dsODN, se extrae ADN genómico (ADNg) del cultivo celular y se fragmenta en fragmentos de 500 pb mediante sonicación . El ADNg fragmentado resultante se somete a reparación de extremos y ligación de adaptadores. A partir de aquí, el ADN que contiene específicamente el inserto dsODN se amplifica mediante dos rondas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que procede de forma unidireccional a partir de los cebadores complementarios al dsODN. Este proceso permite la lectura de las secuencias adyacentes, tanto la hebra sentido como la antisentido, que flanquean el inserto. El producto final es una variedad de amplicones que describen la distribución de las roturas de doble cadena (DSB), contienen índices para la diferenciación de muestras, adaptadores p5 y p7 de la celda de flujo de Illumina y las secuencias que flanquean el casete dsODN. ^{[ 1 ]}

GUIDE-Seq es capaz de detectar roturas de doble cadena (DSB) raras que ocurren con una frecuencia del 0,1%, sin embargo, esto puede deberse a las limitaciones de las plataformas de secuenciación de nueva generación . Cuanto mayor sea la profundidad de lectura que un instrumento pueda alcanzar, mejor podrá detectar eventos más raros. ^{[ 1 ]} Además, GUIDE-Seq es capaz de detectar sitios no predichos por los métodos "in silico", que a menudo predicen sitios basándose en la similitud de secuencia y el porcentaje de discrepancia. ^{[ 1 ]} Ha habido casos en los que GUIDE-Seq no ha detectado ningún objetivo fuera de objetivo para ciertos ARN guía, lo que sugiere que algunas nucleasas guiadas por ARN pueden no tener objetivos fuera de objetivo asociados. ^{[ 1 ] [ 2 ]} GUIDE-Seq se ha utilizado para demostrar que las variantes modificadas de Cas9 pueden tener efectos fuera de objetivo reducidos. ^{[ 3 ]}