Extracción de gel

En biología molecular , la extracción o aislamiento en gel es una técnica que se utiliza para aislar un fragmento deseado de ADN intacto de un gel de agarosa tras la electroforesis en gel de agarosa . Después de la extracción, los fragmentos de interés se pueden mezclar, precipitar y ligar enzimáticamente en varios pasos sencillos. Este proceso, que generalmente se realiza con plásmidos , es la base de la ingeniería genética rudimentaria .

Después de analizar las muestras de ADN en un gel de agarosa, la extracción consta de cuatro pasos básicos: identificar los fragmentos de interés, aislar las bandas correspondientes, aislar el ADN de esas bandas y eliminar las sales y el colorante que las acompañan.

Para empezar, se ilumina el gel con luz ultravioleta para visualizar todo el ADN teñido con bromuro de etidio . Es fundamental evitar exponer el ADN a radiación mutagénica durante más tiempo del estrictamente necesario. Se identifica la banda deseada y se extrae físicamente con un cubreobjetos o una cuchilla de afeitar . El fragmento de gel extraído debe contener el ADN deseado. Un método alternativo, que utiliza la tinción de gel SYBR Safe DNA e iluminación con luz azul, evita el daño al ADN asociado con el bromuro de etidio y la luz ultravioleta. ^{[ 1 ]}

Existen diversas estrategias para aislar y limpiar el fragmento de ADN de interés.

Existen kits de extracción de gel disponibles de varios fabricantes importantes de biotecnología a un costo final aproximado de 1 a 2 dólares estadounidenses por muestra. Los protocolos incluidos en estos kits generalmente requieren la disolución del fragmento de gel en 3 volúmenes de agente caotrópico a 50  °C, seguida de la aplicación de la solución a una columna de centrifugación (el ADN permanece en la columna), un lavado con etanol al 70 % (el ADN permanece en la columna, se eliminan las sales y las impurezas) y la elución del ADN en un pequeño volumen (30  μL) de agua o tampón. ^{[ 2 ]}

El fragmento de gel se coloca en un tubo de diálisis permeable a los fluidos pero impermeable a las moléculas del tamaño del ADN, impidiendo así que el ADN atraviese la membrana al sumergirlo en tampón TE . Se establece un campo eléctrico alrededor del tubo (de forma similar a la electroforesis en gel) durante el tiempo suficiente para que el ADN se separe del gel pero permanezca en el tubo. A continuación, se puede extraer la solución del tubo con una pipeta, la cual contendrá el ADN deseado con un fondo mínimo.

El método tradicional de extracción de gel consiste en crear una bolsa doblada con papel encerado Parafilm y colocar el fragmento de agarosa en su interior. La agarosa se comprime con un dedo en una esquina de la bolsa, licuando parcialmente el gel y su contenido. Las gotas de líquido se dirigen hacia fuera de la bolsa, sobre una pieza exterior de Parafilm, donde se pipetean en un tubo pequeño. Una extracción con butanol elimina la tinción de bromuro de etidio, seguida de una extracción con fenol/cloroformo del fragmento de ADN limpio.

La desventaja del aislamiento en gel es que el ruido de fondo solo se puede eliminar si se identifica físicamente mediante luz ultravioleta. Si dos bandas están muy cerca, puede ser difícil separarlas sin que se produzca contaminación. Para identificar claramente la banda de interés, pueden ser necesarias digestiones de restricción adicionales. Los sitios de restricción específicos de bandas no deseadas de tamaño similar pueden ayudar a eliminar estos posibles contaminantes.