Primer paseo

La técnica Primer Walking se utiliza para clonar un gen (p. ej., un gen causante de enfermedad) a partir de sus marcadores más cercanos conocidos (p. ej., un gen conocido). Por consiguiente, se emplea en proyectos de clonación y secuenciación en plantas, hongos y mamíferos con pequeñas alteraciones. Esta técnica, también conocida como "secuenciación dirigida", utiliza una serie de reacciones de secuenciación de Sanger para confirmar la secuencia de referencia de un plásmido o producto de PCR conocido (servicio de confirmación de secuencia) o para descubrir la secuencia desconocida de un plásmido o producto de PCR completo mediante el diseño de cebadores para secuenciar secciones superpuestas (servicio de descubrimiento de secuencia). ^{[ 1 ]}

El método Primer Walking permite determinar la secuencia de ADN hasta un rango de 1,3–7,0 kb, mientras que el método Chromosome Walking se utiliza para producir clones de secuencias génicas ya conocidas. ^{[ 2 ]} Los fragmentos demasiado largos no pueden secuenciarse en una sola lectura mediante el método de terminación de cadena . Este método funciona dividiendo la secuencia larga en varias secuencias cortas consecutivas. El ADN de interés puede ser un inserto de plásmido , un producto de PCR o un fragmento que representa un hueco al secuenciar un genoma. El término "Prime Walking" se utiliza cuando el objetivo principal es secuenciar el genoma. El término "Chromosome Walking" se utiliza cuando se conoce la secuencia, pero no existe un clon de un gen. Por ejemplo, el gen de una enfermedad puede estar ubicado cerca de un marcador específico, como un RFLP, en la secuencia. ^{[ 2 ]} Chromosome Walking es una técnica utilizada para clonar un gen (p. ej., un gen causante de una enfermedad) a partir de sus marcadores más cercanos conocidos (p. ej., un gen conocido) y, por lo tanto, se utiliza con modificaciones moderadas en proyectos de clonación y secuenciación en plantas, hongos y animales. Dicho de otro modo, se utiliza para encontrar, aislar y clonar una secuencia específica cercana al gen que se va a mapear. Las bibliotecas de fragmentos grandes, principalmente bibliotecas de cromosomas artificiales bacterianos , se utilizan sobre todo en proyectos genómicos. Para identificar la colonia deseada y seleccionar un clon en particular, la biblioteca se analiza primero con una sonda específica. Tras el análisis, el clon se superpone con la sonda y se mapean los fragmentos superpuestos. Estos fragmentos se utilizan como una nueva sonda (fragmentos cortos de ADN obtenidos de los extremos 3' o 5' de los clones) para identificar otros clones. Una biblioteca consta aproximadamente de 96 clones, y cada clon contiene un inserto diferente. La sonda uno identifica λ1 y λ2 al superponerse con ellos. La sonda dos, derivada de los clones λ2, se utiliza para identificar λ3, y así sucesivamente. La orientación de los clones se determina mediante el mapeo de restricción de los mismos. De este modo, se pueden identificar nuevas regiones cromosómicas presentes en las proximidades de un gen. El rastreo cromosómico es laborioso, y el aterrizaje cromosómico es el método de elección para la identificación de genes. Este método requiere el descubrimiento de un marcador que esté firmemente relacionado con el locus mutante. ^{[ 3 ]}

El fragmento se secuencia primero como si fuera un fragmento más corto. La secuenciación se realiza desde cada extremo utilizando cebadores universales o diseñados específicamente. Esto debería identificar las primeras 1000 bases aproximadamente. Para secuenciar completamente la región de interés, es necesario diseñar y sintetizar nuevos cebadores (complementarios a las últimas 20 bases de la secuencia conocida) para obtener información de secuencia continua. ^{[ 4 ]}

La secuenciación por desplazamiento de cebadores es un ejemplo de secuenciación dirigida, ya que el cebador se diseña a partir de una región conocida del ADN para guiar la secuenciación en una dirección específica. En contraste con la secuenciación dirigida, la secuenciación aleatoria de ADN es una estrategia de secuenciación más rápida.

Existe una técnica de la "época" de la secuenciación del genoma. El método subyacente para la secuenciación es el método de terminación de cadena de Sanger, que puede tener longitudes de lectura de entre 100 y 1000 pares de bases (dependiendo de los instrumentos utilizados). Esto significa que hay que dividir moléculas de ADN más largas, clonarlas y posteriormente secuenciarlas. Hay dos métodos posibles. ^{[ 5 ]}

La primera se denomina secuenciación por desplazamiento cromosómico (o por cebadores) y comienza con la secuenciación del primer fragmento. A continuación, se secuencia el siguiente fragmento (contiguo) utilizando un cebador complementario al final de la primera lectura, y así sucesivamente. Esta técnica no requiere mucho ensamblaje, pero sí muchos cebadores y es relativamente lenta. ^{[ 5 ]}

Para superar este problema, se desarrolló el método de secuenciación de escopeta. En este método, el ADN se divide en diferentes fragmentos (no todos en el mismo lugar), se clona y se secuencia con cebadores específicos para el vector utilizado para la clonación. Esto genera secuencias superpuestas que luego deben ensamblarse en una sola secuencia en la computadora. Este método permite la paralelización de la secuenciación (se pueden preparar y ejecutar muchas reacciones de secuenciación al mismo tiempo), lo que acelera considerablemente el proceso y evita la necesidad de cebadores específicos para cada secuencia. El desafío radica en organizar las secuencias en su orden correcto, ya que las superposiciones no son tan evidentes. Para resolver este problema, se realiza un primer borrador y luego se resecuencian las regiones críticas utilizando otras técnicas, como el rastreo de cebadores. ^{[ 5 ]}

El proceso general es el siguiente: Se utiliza un cebador que coincide con el inicio del ADN que se va a secuenciar para sintetizar una cadena corta de ADN adyacente a la secuencia desconocida, comenzando con el cebador (véase PCR ). La nueva cadena corta de ADN se secuencia mediante el método de terminación de cadena. El extremo de la cadena secuenciada se utiliza como cebador para la siguiente parte de la secuencia larga de ADN, de ahí el término "caminar".

El método se puede utilizar para secuenciar cromosomas completos (de ahí el término "caminata cromosómica"). ^{[ 6 ]} La caminata de cebadores también fue la base para el desarrollo de la secuenciación de escopeta , que utiliza cebadores aleatorios en lugar de los elegidos específicamente.

• salto cromosómico
• Aterrizaje cromosómico
• Secuenciación por fragmentación aleatoria : un método alternativo que utiliza subcadenas aleatorias, en lugar de consecutivas.

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