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ARN guía

El ARN guía (ARNg) o ARN guía simple (ARNgs) es una secuencia corta de ARN que guía una proteína asociada a CRISPR hacia su secuencia de ácido nucleico diana mediante el apaream...

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El ARN guía (ARNg) o ARN guía simple (ARNgs) es una secuencia corta de ARN que guía una proteína asociada a CRISPR hacia su secuencia de ácido nucleico diana mediante el apareamiento de bases de Watson-Crick . [ 1 ] [ 2 ] En bacterias y arqueas , los ARNg forman parte del sistema CRISPR -Cas, que actúa como defensa inmunitaria adaptativa para proteger al organismo de los virus. En este caso, los ARNg cortos detectan ADN extraño y dirigen las enzimas Cas que degradan el ácido nucleico extraño. [ 1 ] [ 3 ]

Historia

El ARN guía para la edición de ARN fue descubierto en 1990 por B. Blum, N. Bakalara y L. Simpson mediante hibridación Northern blot en el ADN del maxicírculo mitocondrial del parásito eucariota Leishmania tarentolae. Investigaciones posteriores, a lo largo de mediados de la década de 2000 y los años siguientes, exploraron la estructura y función del ARN guía y el sistema CRISPR-Cas. Un avance significativo se produjo en 2012, cuando se descubrió que el ARN guía podía dirigir la endonucleasa Cas9 para introducir cortes específicos en el ADN de doble cadena. Este descubrimiento condujo al Premio Nobel de Química de 2020 , otorgado a Jennifer Doudna y Emmanuelle Charpentier por sus contribuciones al desarrollo de la tecnología de edición genética CRISPR-Cas9.

ARN guía en protistas

Los protistas tripanosomátidos y otros cinetoplástidos tienen un proceso de modificación de ARN postranscripcional conocido como "edición de ARN" que realiza una inserción/deleción de uridina dentro de las mitocondrias . [ 4 ] [ 5 ] Este ADN mitocondrial es circular y está dividido en maxicírculos y minicírculos. Una mitocondria contiene alrededor de 50 maxicírculos que tienen regiones codificantes y no codificantes y constan de aproximadamente 20 kilobases (kb). La región codificante está altamente conservada (16-17 kb) y la región no codificante varía según la especie. Los minicírculos son pequeños (alrededor de 1 kb) pero más numerosos que los maxicírculos, una mitocondria contiene varios miles de minicírculos. [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] Los maxicírculos pueden codificar " criptogenes " y algunos ARNg; los minicírculos pueden codificar la mayoría de los ARNg. Algunos genes de ARN guía muestran sitios de inserción y deleción idénticos aunque tengan secuencias diferentes, mientras que otras secuencias de ARN guía no son complementarias al ARNm preeditado. Las moléculas de maxicírculos y minicírculos se concatenan en una red gigante de ADN dentro de la mitocondria. [ 9 ] [ 8 ] [ 10 ]

La mayoría de los transcritos de maxicírculos no pueden traducirse en proteínas debido a cambios en el marco de lectura de sus secuencias. Estos cambios se corrigen postranscripcionalmente mediante la inserción y eliminación de residuos de uridina en sitios precisos, lo que crea un marco de lectura abierto . Este marco de lectura abierto se traduce posteriormente en una proteína homóloga a las proteínas mitocondriales presentes en otras células. [ 11 ] El proceso de inserción y eliminación de uridina está mediado por ARN guía cortos (ARNg), que codifican la información de edición mediante secuencias complementarias y permiten el apareamiento de bases entre guanina y uracilo (GU), así como entre guanina y citosina (GC), facilitando el proceso de edición. [ 12 ]

La función del complejo ARNg-ARNm

Los ARN guía se transcriben principalmente a partir de la región intergénica del maxicírculo de ADN y tienen secuencias complementarias al ARNm. El extremo 3' de los ARN guía contiene una cola de oligo 'U' (de 5 a 24 nucleótidos de longitud) que se encuentra en una región no codificante, pero interactúa y forma un complejo estable con regiones ricas en A y G del ARNm y ARN guía preeditados, que se estabilizan termodinámicamente mediante anclajes 5' y 3'. [ 13 ] Este híbrido inicial ayuda en el reconocimiento del sitio específico del ARNm que se va a editar. [ 14 ]

La edición de ARN generalmente progresa desde el extremo 3' al extremo 5' del ARNm. El proceso de edición inicial comienza cuando un ARN guía (ARNg) forma un dúplex de ARN con una secuencia de ARNm complementaria ubicada justo después del sitio de edición. Este apareamiento recluta varios complejos de ribonucleoproteínas que dirigen la escisión de la primera base no coincidente adyacente al anclaje ARNg-ARNm. Posteriormente, la uridiltransferasa inserta una 'U' en el extremo 3', y la ARN ligasa une los dos extremos separados. El proceso se repite en el siguiente sitio de edición anterior de manera similar. Un solo ARNg generalmente codifica la información para varios sitios de edición (un "bloque" de edición), cuya edición produce un dúplex completo de ARNg/ARNm. Este proceso de edición secuencial se conoce como el modelo de cascada enzimática. [ 14 ] [ 12 ] [ 15 ]

En el caso de los ARNm "pan-editados", [ 16 ] el dúplex se desenrolla y otro ARNg forma un dúplex con la secuencia de ARNm editada, iniciando otra ronda de edición. Estos ARNg superpuestos forman un "dominio" de edición. Algunos genes contienen múltiples dominios de edición. [ 17 ] El grado de edición para cualquier gen en particular varía entre las especies de tripanosomátidos. La variación consiste en la pérdida de edición en el lado 3', probablemente debido a la pérdida de clases de secuencias de minicírculos que codifican ARNg específicos. Se ha propuesto un modelo de retroposición [ 18 ] para explicar la pérdida parcial, y en algunos casos, completa de la edición a través de la evolución. Aunque la pérdida de edición suele ser letal, tales pérdidas se han observado en cepas de laboratorio antiguas. El mantenimiento de la edición a lo largo de la larga historia evolutiva de estos protistas antiguos sugiere la presencia de una ventaja selectiva, cuya naturaleza exacta aún es incierta. [ 16 ]

No está claro por qué los tripanosomátidos utilizan un mecanismo tan elaborado para producir ARNm. Podría haberse originado en las mitocondrias primitivas del ancestro del linaje de protistas kintoplástidos, ya que está presente en los bodónidos , que son ancestros de los tripanosomátidos, [ 19 ] y puede que no esté presente en los euglenoides , que se ramificaron del mismo ancestro común que los kinetoplástidos.

Secuencias de ARN guía

En el protozoo Leishmania tarentolae , 12 de los 18 genes mitocondriales se editan mediante este proceso. Uno de estos genes es Cyb. El ARNm se edita dos veces consecutivas. Para la primera edición, la secuencia relevante en el ARNm es la siguiente:

ARNm 5' AAAGAAAAGGCUUUAACUUCAGGUUGU 3'

El extremo 3' se utiliza para anclar el ARN guía (en este caso, el ARN guía gCyb-I) mediante el apareamiento de bases (se utilizan algunos pares G/U). El extremo 5' no coincide exactamente y una de las tres endonucleasas específicas corta el ARNm en el sitio de desajuste.

ARNg 3' AAUAAUAAAUUUUUAAAUAUAAAUAGAAAAUUGAAGUUCAGUA 5' ARNm 5' AA AGAAA AGGC UUUAACUUCAGGUUGU 3'

El ARNm ahora se "repara" añadiendo U en cada sitio de edición sucesivamente, dando como resultado la siguiente secuencia:

ARNg 3' AAUAAUAAAUUUUUAAAUAUAAAUAGAAAAUUGAAGUUCAGUA 5' ARNm 5' UUAUUAUUUAGAAAUUUAUGUUGUCUUUUAACUUCAGGUUGU 3'

Este gen en particular tiene dos sitios de edición de gRNA superpuestos. El extremo 5' de esta sección es el ancla 3' para otro gRNA (gRNA gCyb-II). [ 9 ]

ARN guía en procariotas

CRISPR en procariotas

Los procariotas, como las bacterias y las arqueas, utilizan CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y espaciadas regularmente) y sus enzimas Cas asociadas como sistema inmunitario adaptativo. Cuando los procariotas son infectados por fagos y logran defenderse del ataque, enzimas Cas específicas cortan el ADN (o ARN) del fago e integran los fragmentos en los espacios intersticiales de la secuencia CRISPR. Estos segmentos almacenados son reconocidos durante futuros ataques virales, lo que permite a las enzimas Cas utilizar copias de ARN de estos segmentos, junto con sus secuencias CRISPR asociadas, como ARN guía para identificar y neutralizar las secuencias extrañas. [ 20 ] [ 21 ] [ 22 ]

Estructura esquemática del complejo ternario Cas9-sgRNA-ADN

Estructura

El ARN guía se dirige a las secuencias complementarias mediante el apareamiento de bases de Watson-Crick. [ 23 ] En el sistema CRISPR/cas de tipo II, el sgRNA dirige a la enzima Cas para que se dirija a regiones específicas del genoma para la escisión dirigida del ADN. El sgRNA es una combinación artificial de dos moléculas de ARN: ARN CRISPR ( crRNA ) y crRNA transactivador ( tracrRNA ). El componente crRNA es responsable de la unión a la región de ADN específica del objetivo, mientras que el componente tracrRNA es responsable de la activación de la actividad endonucleasa Cas9. Estos dos componentes están unidos por una estructura de tetrabucle corta, lo que da como resultado la formación del sgRNA. El tracrRNA consta de pares de bases que forman una estructura de tallo-bucle, lo que permite su unión a la enzima endonucleasa . La transcripción del locus CRISPR genera crRNA, que contiene regiones espaciadoras flanqueadas por secuencias repetidas, típicamente de 18 a 20 pares de bases (pb) de longitud. Este crRNA guía a la endonucleasa Cas9 hacia la región diana complementaria del ADN, donde lo corta, formando lo que se conoce como complejo efector. Las modificaciones en la secuencia del crRNA dentro del sgRNA pueden alterar el sitio de unión, permitiendo la focalización precisa de diferentes regiones del ADN, convirtiéndolo así en un sistema programable para la edición del genoma. [ 24 ] [ 25 ] [ 26 ]

Aplicaciones

Diseño de ARN guía

La especificidad de la secuencia diana de CRISPR-Cas9 está determinada por la secuencia de 20 nucleótidos (nt) en el extremo 5' del ARN guía (ARNg). La secuencia diana deseada debe preceder al motivo adyacente al protoespaciador (PAM), que es una secuencia corta de ADN, generalmente de 2 a 6 pares de bases, que sigue a la región de ADN que el sistema CRISPR, como CRISPR-Cas9, va a cortar. El PAM es necesario para que la nucleasa Cas corte y suele estar ubicado de 3 a 4 nucleótidos corriente abajo del sitio de corte. Una vez que el ARNg se aparea con la secuencia diana, Cas9 induce una ruptura de doble cadena aproximadamente 3 nucleótidos corriente arriba del PAM. [ 27 ] [ 28 ]

El contenido óptimo de GC de la secuencia guía debe ser superior al 50 %. Un mayor contenido de GC mejora la estabilidad del dúplex ARN-ADN y reduce la hibridación fuera de objetivo. La longitud de las secuencias guía suele ser de 20 pb, pero también puede variar entre 17 y 24 pb. Una secuencia más larga minimiza los efectos fuera de objetivo. Las secuencias guía de menos de 17 pb corren el riesgo de dirigirse a múltiples loci . [ 29 ] [ 30 ] [ 24 ]

CRISPR Cas9

El complejo cas9, que ilustra el ARN guía (gRNA), el PAM y la rotura de doble cadena inducida en el ADN objetivo.

CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y espaciadas regularmente)/Cas9 es una técnica utilizada para la edición genética y la terapia génica. Cas es una enzima endonucleasa que corta el ADN en una ubicación específica dirigida por un ARN guía. Esta es una técnica específica para el objetivo que puede introducir la inactivación o la inserción de genes, dependiendo de la vía de reparación de doble cadena. La evidencia muestra que, tanto in vitro como in vivo, el ARN guía es necesario para que Cas9 se una a la secuencia de ADN objetivo. El sistema CRISPR-Cas9 consta de tres etapas principales. La primera etapa implica la extensión de bases en la región del locus CRISPR mediante la adición de espaciadores de ADN extraños en la secuencia del genoma. Proteínas como cas1 y cas2 ayudan a encontrar nuevos espaciadores. La siguiente etapa implica la transcripción de CRISPR: el pre-ARN guía (ARN precursor CRISPR) se expresa mediante la transcripción de la matriz de repeticiones-espaciadores CRISPR. Tras una modificación adicional, el pre-ARN guía se convierte en regiones flanqueadas por un único espaciador, formando un ARN guía corto. El proceso de maduración del ARN es similar en los tipos I y III, pero diferente en el tipo II. La tercera etapa implica la unión de la proteína Cas9 y su dirección para escindir el segmento de ADN. La proteína Cas9 se une a una forma combinada de crRNA y tracrRNA, formando un complejo efector. Este actúa como ARN guía para la proteína Cas9, dirigiendo su actividad endonucleasa. [ 31 ] [ 2 ] [ 3 ]

mutagénesis del ARN

Un método importante de regulación génica es la mutagénesis de ARN, que puede introducirse mediante la edición de ARN con la ayuda de ARN guía (ARNg). [ 32 ] El ARN guía reemplaza la adenosina por inosina en sitios diana específicos, modificando el código genético. [ 33 ] La adenosina desaminasa actúa sobre el ARN, provocando modificaciones postranscripcionales al alterar codones y diferentes funciones proteicas. Los ARN guía son pequeños ARN nucleolares que, junto con las riboproteínas, realizan alteraciones intracelulares del ARN, como la ribometilación en el ARNr y la introducción de pseudouridina en el ARN prerribosómico. [ 34 ] Los ARN guía se unen a la secuencia de ARN antisentido y regulan la modificación del ARN. Se ha observado que el ARN de interferencia pequeño (ARNi) y el microARN (ARNmi) se utilizan generalmente como secuencias de ARN diana, y las modificaciones son relativamente fáciles de introducir debido a su pequeño tamaño. [ 35 ]

Véase también

Referencias

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  32. ↑ Bass, Brenda L. (2002). "Edición de ARN por adenosina desaminasas que actúan sobre el ARN" . Annual Review of Biochemistry . 71 : 817–846 . doi : 10.1146/annurev.biochem.71.110601.135501 . ISSN 0066-4154 . PMC 1823043. PMID 12045112 .   
  33. ^ Fukuda, Masatora; Umeno, Hiromitsu; Nariz, Kanako; Nishitarumizu, Azusa; Noguchi, Ryoma; Nakagawa, Hiroyuki (2 de febrero de 2017). "Construcción de un ARN guía para la mutagénesis de ARN dirigida al sitio utilizando la edición de ARN intracelular A a I" . Informes científicos . 7 41478. Código Bib : 2017NatSR...741478F . doi : 10.1038/srep41478 . ISSN 2045-2322 . PMC 5288656 . PMID 28148949 .   
  34. ↑ Maden, BE (1990). "Los numerosos nucleótidos modificados en el ARN ribosómico eucariota". Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology . 39 : 241–303 . doi : 10.1016/s0079-6603(08)60629-7 . ISBN 978-0-12-540039-8ISSN 0079-6603 PMID 2247610​​​  
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Lecturas adicionales

  • Edición de ARN in vitro mediante inserción de uridina dirigida por ARN guíahttp://www.jbc.org/content/272/7/4212.full
  • Blum, Beat; Simpson, Larry (1990). "Los ARN guía en las mitocondrias de los cinetoplástidos tienen una cola de oligo(U) 3′ no codificada involucrada en el reconocimiento de la región preeditada". Cell . 62 (2): 391– 397. doi : 10.1016 / 0092-8674(90)90375-O . PMID 1695552. S2CID 2181338 .  
  • Kurata, Morito; Wolf, Natalie K.; Lahr, Walker S.; Weg, Madison T.; Kluesner, Mitchell G.; Lee, Samantha; Hui, Kai; Shiraiwa, Masano; Webber, Beau R.; Moriarity, Branden S. (2018). "Ingeniería genómica altamente multiplexada mediante matrices de ARN guía CRISPR/Cas9" . PLOS ONE . 13 (9) e0198714. Bibcode : 2018PLoSO..1398714K . doi : 10.1371/ journal.pone.0198714 . PMC 6141065. PMID 30222773 .  
  • Khan, Fehad J.; Yuen, Garmen; Luo, Ji (2019). "Eliminación génica multiplexada mediante CRISPR/Cas9 con cotransfección simple de crRNA:tracrRNA" . Cell & Bioscience . 9 41. doi : 10.1186/s13578-019-0304-0 . PMC 6528186. PMID 31139343 .  
  • Nishimasu, Hiroshi; Nureki, Osamu (2017). "Estructuras y mecanismos de las nucleasas efectoras guiadas por ARN CRISPR" . Current Opinion in Structural Biology . 43 : 68–78 . doi : 10.1016/j.sbi.2016.11.013 . PMID 27912110 . 
  • Chuai, Guohui; Mamá, Hanhui; Yan, Jifang; Chen, Ming; Hong, Nanfang; Xue, Dongyu; Zhou, Chi; Zhu, Chenyu; Chen, Ke; Duan, Bin; Gu, Feng; Qu, Sheng; Huang, Deshuang; Wei, Jia; Liu, Qi (2018). "DeepCRISPR: diseño de ARN guía CRISPR optimizado mediante aprendizaje profundo" . Biología del genoma . 19 (1): 80. doi : 10.1186/s13059-018-1459-4 . PMC 6020378 . PMID 29945655 .