H2AFX

La variante de histona H2AX constituye aproximadamente entre el 2 y el 25 % de las histonas H2A en la cromatina de los mamíferos. ^{[ 6 ]} Cuando se produce una rotura de doble cadena en el ADN, se desencadena una secuencia de eventos en la que se altera H2AX.

Poco después de una rotura de doble cadena, una proteína específica que interactúa con la cromatina y afecta su arquitectura se fosforila y luego se libera de ella. Esta proteína, la proteína de heterocromatina 1 (HP1)-beta ( CBX1 ), se une a la histona H3 metilada en la lisina 9 (H3K9me). La liberación de la mitad del máximo de HP1-beta del ADN dañado ocurre en un segundo. ^{[ 7 ]} La liberación de HP1-beta desencadena una alteración dinámica en la estructura de la cromatina. Esta alteración promueve la fosforilación de H2AX por ATM , ATR y DNA-PK , ^{[ 8 ]} permitiendo la formación de γH2AX (H2AX fosforilada en la serina 139). γH2AX se puede detectar tan solo 20 segundos después de la irradiación de las células (con formación de rotura de doble cadena de ADN), y la acumulación de la mitad del máximo de γH2AX ocurre en un minuto. ^{[ 6 ]} La cromatina con γH2AX fosforilada se extiende aproximadamente un millón de pares de bases a cada lado de una rotura de doble cadena de ADN. ^{[ 6 ]}

MDC1 (proteína 1 del punto de control del daño del ADN mediador) se une a γH2AX y el complejo γH2AX/MDC1 orquesta interacciones adicionales en la reparación de roturas de doble cadena. ^{[ 9 ]} Las ubiquitina ligasas RNF8 y RNF168 se unen al complejo γH2AX/MDC1, ubiquitilizando otros componentes de la cromatina. Esto permite el reclutamiento de BRCA1 y 53BP1 a la cromatina γH2AX/MDC1 larga y modificada. ^{[ 9 ]} Otras proteínas que se ensamblan de forma estable en la cromatina γH2AX modificada extensa son el complejo MRN (un complejo proteico que consta de Mre11 , Rad50 y Nbs1 ), RAD51 y la quinasa ATM . ^{[ 10 ] [ 11 ]} Otros componentes de reparación del ADN, como RAD52 y RAD54, interactúan rápida y reversiblemente con los componentes centrales asociados de forma estable a la cromatina modificada por γH2AX. ^{[ 11 ]} El nivel constitutivo de expresión de γH2AX en células vivas, no tratadas con agentes exógenos, probablemente representa el daño al ADN causado por oxidantes endógenos generados durante la respiración celular. ^{[ 12 ]}

El empaquetamiento del ADN eucariota en cromatina representa una barrera para todos los procesos basados ​​en ADN que requieren el reclutamiento de enzimas a sus sitios de acción. Para permitir la reparación del ADN, la cromatina debe ser remodelada .

γH2AX, la forma fosforilada de H2AX, participa en los pasos que conducen a la descondensación de la cromatina después de roturas de doble cadena de ADN. γH2AX no causa, por sí mismo, la descondensación de la cromatina, pero dentro de los 30 segundos de radiación ionizante , la proteína RNF8 puede detectarse asociada con γH2AX. ^{[ 13 ]} RNF8 media una descondensación extensa de la cromatina, a través de su interacción posterior con CHD4 , ^{[ 14 ]} un componente del complejo de remodelación y desacetilación de nucleosomas NuRD .

Un ensayo para γH2AX generalmente refleja la presencia de roturas de doble cadena en el ADN, aunque el ensayo también puede indicar otros fenómenos menores. ^{[ 15 ]} Por un lado, evidencia abrumadora respalda una fuerte correlación cuantitativa entre la formación de focos de γH2AX y la inducción de roturas de doble cadena de ADN después de la exposición a radiación ionizante , basada en rendimientos absolutos y distribuciones inducidas por unidad de dosis. ^{[ 15 ]} Por otro lado, no solo la formación de focos de γH2AX distintos, sino también la inducción de señales pannucleares de γH2AX se han reportado como una reacción celular a varios factores de estrés distintos de la radiación ionizante. ^{[ 16 ]} La señal de γH2AX es siempre más fuerte en las roturas de doble cadena de ADN que en la cromatina no dañada. ^{[ 16 ]} Se cree que el γH2AX en la cromatina no dañada posiblemente se genera a través de la fosforilación directa de H2AX por quinasas activadas, muy probablemente difundiendo desde sitios de daño del ADN. Al utilizar γH2AX como marcador de roturas de doble cadena, es importante reconocer que se trata de un indicador indirecto que puede ser útil para representar la reparación del daño del ADN. No representa las roturas de doble cadena en sí mismas, y esto requiere una cuidadosa consideración al interpretar los datos de dichos ensayos. ^{[ 17 ]}

El ensayo γH2AX tiene varias desventajas, por lo que se han creado nuevos ensayos. ^{[ 18 ]}