Espectroscopia de resonancia magnética nuclear bidimensional

El primer y más popular experimento de RMN bidimensional es la secuencia de espectroscopia de correlación homonuclear (COSY), que se utiliza para identificar espines acoplados entre sí. Consiste en un único pulso de RF (p1) seguido de un tiempo de evolución específico (t1), seguido de un segundo pulso (p2) y, finalmente, un período de medición (t2). ^{[ 7 ]}

El experimento de espectroscopia de correlación (COSY) funciona correlacionando núcleos acoplados entre sí mediante acoplamiento escalar, también conocido como acoplamiento J. ^{[ 8 ]} Este acoplamiento es la interacción entre espines nucleares conectados por enlaces, que se observa típicamente entre núcleos separados por 2 o 3 enlaces (por ejemplo, protones vecinales). Al detectar estas interacciones, COSY proporciona información vital sobre la conectividad entre átomos dentro de una molécula, lo que la convierte en una herramienta crucial para la elucidación estructural en química orgánica.

El experimento COSY genera un espectro bidimensional con desplazamientos químicos a lo largo del eje x (horizontal) y el eje y (vertical) e implica varios pasos clave. ^{[ 1 ]} Primero, la muestra se excita utilizando una serie de pulsos de radiofrecuencia (RF), llevando los espines nucleares a un estado de energía más alta . Después del primer pulso de RF, el sistema evoluciona libremente durante un período llamado t ₁ , durante el cual los espines precesan a frecuencias que corresponden a sus desplazamientos químicos. La correlación entre núcleos se logra variando incrementalmente el tiempo de evolución (t ₁ ) para capturar interacciones indirectas. Esta serie de experimentos, cada uno con un valor diferente de t ₁ , permite la detección de desplazamientos químicos de núcleos que pueden no ser observados directamente en un espectro unidimensional. A medida que se incrementa t ₁ , se producen picos cruzados en el espectro 2D resultante, que representan interacciones como el acoplamiento o la proximidad espacial entre núcleos. Este enfoque ayuda a trazar un mapa de las conexiones atómicas, proporcionando una comprensión más profunda de la estructura molecular y facilitando la interpretación de sistemas complejos.

Los picos cruzados resultan de un fenómeno llamado transferencia de magnetización , y su presencia indica que dos núcleos están acoplados, los cuales tienen los dos desplazamientos químicos diferentes que conforman las coordenadas del pico cruzado. Cada acoplamiento produce dos picos cruzados simétricos por encima y por debajo de la diagonal. Es decir, un pico cruzado se produce cuando existe una correlación entre las señales del espectro a lo largo de cada uno de los dos ejes en estos valores. Una forma visual sencilla de determinar qué acoplamientos representa un pico cruzado es encontrar el pico diagonal que se encuentra directamente encima o debajo del pico cruzado, y el otro pico diagonal que se encuentra directamente a la izquierda o a la derecha del pico cruzado. Los núcleos representados por esos dos picos diagonales están acoplados. ^{[ 7 ]}

A continuación, se aplica un segundo pulso de RF para permitir la transferencia de magnetización entre los núcleos acoplados. La señal resultante se registra continuamente durante un período de detección (t₂ ₎ después del segundo pulso de RF. Los datos se procesan mediante la transformada de Fourier a lo largo de los ejes t₁ _y t₂ _, creando un espectro bidimensional con picos representados en la diagonal y fuera de ella.

Al interpretar el espectro COSY, los picos diagonales corresponden a los desplazamientos químicos unidimensionales de los núcleos individuales, de forma similar a los picos estándar en un espectro de RMN unidimensional. La característica clave de un espectro COSY es la presencia de picos cruzados, como se muestra en la Figura 1, que indican el acoplamiento entre pares de núcleos. Estos picos cruzados proporcionan información crucial sobre la conectividad dentro de una molécula, mostrando que los dos núcleos están conectados por un pequeño número de enlaces, generalmente dos o tres.

La técnica COSY resulta especialmente útil al trabajar con moléculas complejas como productos naturales, péptidos y proteínas, donde comprender la conectividad de los diferentes núcleos mediante enlaces es crucial. Si bien la RMN 1D es más directa e ideal para identificar características estructurales básicas, COSY amplía las capacidades de la RMN al proporcionar información más detallada sobre la conectividad molecular.

El espectro bidimensional resultante del experimento COSY muestra las frecuencias de un isótopo único , generalmente hidrógeno ( ^¹H ), a lo largo de ambos ejes. (También se han desarrollado técnicas para generar espectros de correlación heteronuclear, en los que los dos ejes corresponden a isótopos diferentes, como ^¹³C y ¹H ). Los picos diagonales corresponden a los picos de un experimento de RMN 1D, mientras que los picos cruzados indican acoplamientos entre pares de núcleos (de forma similar a como el desdoblamiento ^de multipletes indica acoplamientos en la RMN 1D). ^{[ 7 ]}

COSY-90 es el experimento COSY más común. En COSY-90, el pulso p1 inclina el espín nuclear 90°. Otro miembro de la familia COSY es COSY-45 . En COSY-45 se utiliza un pulso de 45° en lugar de un pulso de 90° para el segundo pulso, p2. La ventaja de un COSY-45 es que los picos diagonales son menos pronunciados, lo que hace más simple hacer coincidir picos cruzados cerca de la diagonal en una molécula grande. Además, los signos relativos de las constantes de acoplamiento (ver Acoplamiento J#Magnitud del acoplamiento J ) se pueden dilucidar a partir de un espectro COSY-45. Esto no es posible usando COSY-90. ^{[ 9 ]} En general, el COSY-45 ofrece un espectro más limpio mientras que el COSY-90 es más sensible.

Otra técnica COSY relacionada es la COSY con filtrado de doble cuanto (DQF). La DQF COSY utiliza un método de selección de coherencia, como el ciclo de fase o los gradientes de campo pulsados , que hacen que solo las señales de coherencias de doble cuanto produzcan una señal observable. Esto tiene el efecto de disminuir la intensidad de los picos diagonales y cambiar su forma de línea de una forma de línea de "dispersión" ancha a una forma de línea de "absorción" más nítida. También elimina los picos diagonales de núcleos desacoplados. Todas estas técnicas tienen la ventaja de que proporcionan un espectro más limpio en el que se evita que los picos diagonales oculten los picos cruzados, que son más débiles en un espectro COSY regular. ^{[ 10 ]}

El experimento TOCSY es similar al experimento COSY, ya que se observan picos cruzados de protones acoplados. Sin embargo, estos picos cruzados se observan no solo para núcleos directamente acoplados, sino también entre núcleos conectados por una cadena de acoplamientos. Esto lo hace útil para identificar redes interconectadas más grandes de acoplamientos de espín. Esta capacidad se logra insertando una serie repetitiva de pulsos que provocan una mezcla isotrópica durante el período de mezcla. Tiempos de mezcla isotrópica más prolongados hacen que la polarización se extienda a través de un número creciente de enlaces. ^{[ 11 ]}

En el caso de los oligosacáridos, cada residuo de azúcar constituye un sistema de espín aislado, lo que permite diferenciar todos los protones de un residuo específico. También existe una versión unidimensional de TOCSY, que permite visualizar el resto del sistema de espín al irradiar un solo protón. Entre los avances recientes en esta técnica se incluye el experimento TOCSY unidimensional con filtro selectivo de desplazamiento químico (CSSF), que produce espectros de mayor calidad y permite extraer de forma fiable las constantes de acoplamiento para ayudar a determinar la estereoquímica.

A veces se denomina a TOCSY "espectroscopia homonuclear de Hartmann - Hahn" (HOHAHA). ^{[ 12 ]}

INADEQUATE ^{[ 13 ]} es un método que se usa frecuentemente para encontrar acoplamientos ^{de 13C} entre átomos de carbono adyacentes. Debido a que la abundancia natural de ^13C es de aproximadamente el 1%, solo alrededor del 0,01% de las moléculas estudiadas tendrán los dos átomos de ^13C cercanos necesarios para una señal en este experimento. Sin embargo, se utilizan métodos de selección de correlación (similares a DQF COSY) para evitar señales de átomos de 13C individuales ^, de modo que las señales dobles de ^13C se puedan resolver fácilmente. Cada par de núcleos acoplados produce un par de picos en el espectro INADEQUATE que tienen la misma coordenada vertical, que es la suma de los desplazamientos químicos de los núcleos; la coordenada horizontal de cada pico es el desplazamiento químico de cada núcleo por separado. ^{[ 14 ]}

La coherencia cuántica simple heteronuclear (HSQC) es una técnica de RMN bidimensional que se utiliza para detectar interacciones entre diferentes tipos de núcleos separados por un enlace, en particular un protón ( ^¹H ) y un heteronúcleo como el carbono ( ^¹³C ) o el nitrógeno ( ^¹⁵N ). ^{[ 17 ]} Este método produce un pico por cada par de núcleos acoplados, cuyas dos coordenadas corresponden a los desplazamientos químicos de los dos átomos acoplados. ^{[ 18 ]}

Este método desempeña un papel importante en la elucidación estructural, especialmente en el análisis de compuestos orgánicos, productos naturales y biomoléculas como proteínas y ácidos nucleicos. La técnica HSQC está diseñada para detectar correlaciones de un enlace entre protones y átomos heteronucleares, lo que permite comprender la conectividad entre el hidrógeno y los átomos heteronucleares mediante la transferencia de magnetización.

El experimento HSQC implica una serie de pasos para generar un espectro de RMN bidimensional. Inicialmente, la muestra se excita mediante pulsos de radiofrecuencia (RF), lo que lleva los espines nucleares a un estado excitado y los prepara para la transferencia de magnetización. A continuación, la magnetización se transfiere del protón al heteronúcleo mediante un acoplamiento escalar de un enlace (acoplamiento J), lo que garantiza que solo los núcleos directamente enlazados participen en la transferencia. Posteriormente, el sistema evoluciona durante un período denominado t₁ _, y la magnetización se transfiere de nuevo del heteronúcleo al protón. Se detecta la señal final, que codifica tanto la información del protón como la del heteronúcleo, y se realiza una transformada de Fourier para crear un espectro 2D que correlaciona los desplazamientos químicos del protón y del heteronúcleo.

HSQC funciona transfiriendo la magnetización del núcleo I (generalmente el protón) al núcleo S (generalmente el heteroátomo) mediante la secuencia de pulsos INEPT . Este primer paso se realiza porque el protón tiene una magnetización de equilibrio mayor, lo que genera una señal más intensa. La magnetización evoluciona y luego se transfiere de nuevo al núcleo I para su observación. Opcionalmente, se puede utilizar un paso adicional de eco de espín para desacoplar la señal, simplificando el espectro al colapsar los multipletes en un solo pico. Las señales desacopladas no deseadas se eliminan repitiendo el experimento dos veces con la fase de un pulso específico invertida. Esto invierte los signos de los picos deseados, pero no de los no deseados, por lo que al restar los dos espectros se obtendrán únicamente los picos deseados. ^{[ 18 ]}

La interpretación del espectro HSQC se basa en la observación de picos cruzados, que indican el enlace directo entre protones y carbonos o nitrógenos. Cada pico cruzado corresponde a un par específico ¹ H- ¹³ C o ¹ H- ¹⁵ N, lo que proporciona asignaciones directas de conectividad 1H-X, donde X es el heteronúcleo ^{[ 17 ].} La técnica HSQC ofrece varias ventajas, incluyendo su enfoque en correlaciones de un enlace, mayor sensibilidad debido a la detección directa de protones y la simplificación de espectros congestionados al resolver señales superpuestas y ayudar en el análisis de moléculas complejas.

La espectroscopia de correlación de múltiples cuantos heteronucleares (HMQC) produce un espectro idéntico al de HSQC, pero utilizando un método diferente. Ambos métodos ofrecen resultados de calidad similar para moléculas de tamaño pequeño a mediano, pero HSQC se considera superior para moléculas más grandes. ^{[ 18 ]}

HMBC detecta correlaciones heteronucleares en rangos más largos, de aproximadamente 2 a 4 enlaces. La dificultad de detectar correlaciones de enlaces múltiples radica en que las secuencias HSQC y HMQC contienen un tiempo de retardo específico entre pulsos, lo que permite la detección únicamente de un rango alrededor de una constante de acoplamiento específica. Esto no representa un problema para los métodos de enlace simple, ya que las constantes de acoplamiento tienden a estar en un rango estrecho; sin embargo, las constantes de acoplamiento de enlaces múltiples abarcan un rango mucho más amplio y no pueden capturarse por completo en un solo experimento HSQC o HMQC. ^{[ 19 ]}

En HMBC, esta dificultad se supera omitiendo uno de estos retardos de una secuencia HMQC. Esto aumenta el rango de constantes de acoplamiento que se pueden detectar y también reduce la pérdida de señal por relajación. El inconveniente es que esto elimina la posibilidad de desacoplar el espectro e introduce distorsiones de fase en la señal. Existe una modificación del método HMBC que suprime las señales de un enlace, dejando solo las señales de enlaces múltiples. ^{[ 19 ]}

En NOESY, la relajación cruzada de Overhauser nuclear entre espines nucleares durante el período de mezcla se utiliza para establecer las correlaciones. El espectro obtenido es similar al de COSY, con picos diagonales y picos cruzados; sin embargo, los picos cruzados conectan resonancias de núcleos espacialmente cercanos en lugar de aquellas acopladas entre sí mediante enlaces. Los espectros NOESY también contienen picos axiales adicionales que no aportan información extra y pueden eliminarse mediante un experimento diferente invirtiendo la fase del primer pulso. ^{[ 20 ]}

Una aplicación de NOESY es el estudio de biomoléculas grandes, como en la RMN de proteínas , en la que a menudo se pueden asignar relaciones utilizando un método de exploración secuencial.

El experimento NOESY también puede realizarse de forma unidimensional mediante la preselección de resonancias individuales. Los espectros se leen con los núcleos preseleccionados emitiendo una señal negativa intensa, mientras que los núcleos vecinos se identifican mediante señales positivas más débiles. Esto solo revela qué picos presentan efectos NOE medibles con la resonancia de interés, pero requiere mucho menos tiempo que el experimento bidimensional completo. Además, si un núcleo preseleccionado cambia de entorno dentro de la escala temporal del experimento, pueden observarse múltiples señales negativas. Esto proporciona información de intercambio similar a la del método de RMN EXSY (espectroscopia de intercambio).

Los experimentos NOESY son una herramienta importante para identificar la estereoquímica de una molécula en disolvente, mientras que la difracción de rayos X de monocristal se utiliza para identificar la estereoquímica de una molécula en estado sólido.

En HOESY, al igual que en NOESY, se utiliza para la relajación cruzada entre espines nucleares. Sin embargo, HOESY puede ofrecer información sobre otros núcleos activos en RMN de manera espacialmente relevante. Algunos ejemplos incluyen núcleos X{Y} o X→Y, como ^1H → ^13C , ^19F → ^13C , ^31P → ^13C o ^77Se → ^13C . Los experimentos suelen observar NOE de protones en X, X{ ^1H }, pero no necesariamente incluyen protones. ^{[ 21 ]}

ROESY es similar a NOESY, excepto que el estado inicial es diferente. En lugar de observar la relajación cruzada desde un estado inicial de magnetización z , la magnetización de equilibrio se rota sobre el eje x y luego se bloquea el espín mediante un campo magnético externo para que no pueda precesar. Este método es útil para ciertas moléculas cuyo tiempo de correlación rotacional cae en un rango donde el efecto Overhauser nuclear es demasiado débil para ser detectable, generalmente moléculas con un peso molecular alrededor de 1000 daltons , porque ROESY tiene una dependencia diferente entre el tiempo de correlación y la constante de velocidad de relajación cruzada. En NOESY, la constante de velocidad de relajación cruzada pasa de positiva a negativa a medida que aumenta el tiempo de correlación, dando un rango donde es cercana a cero, mientras que en ROESY la constante de velocidad de relajación cruzada siempre es positiva. ^{[ 22 ] [ 23 ]}

ROESY a veces se denomina "relajación cruzada apropiada para minimoléculas emuladas por espines bloqueados" (CAMELSPIN). ^{[ 23 ]}