Hispanopedia Wiki
Articulo de referencia

Ribozima en horquilla

Estructura secundaria de una ribozima en horquilla mínima con ARN sustrato unido. Los círculos representan nucleótidos individuales y las líneas indican pares de bases canónicos...

Hispanopedia WikiContenido en espanolLectura gratuita

Estructura secundaria de una ribozima en horquilla mínima con ARN sustrato unido. Los círculos representan nucleótidos individuales y las líneas indican pares de bases canónicos (Watson-Crick).

La ribozima en horquilla es una pequeña sección de ARN que puede actuar como ribozima . Al igual que la ribozima cabeza de martillo, se encuentra en los ARN satélite de los virus vegetales. Se identificó por primera vez en la cadena negativa del ARN satélite del virus de la mancha anular del tabaco (TRSV), donde cataliza reacciones de autocorte y unión ( ligación ) para procesar los productos de la replicación del virus del círculo rodante en moléculas de ARN satélite lineales y circulares. La ribozima en horquilla es similar a la ribozima cabeza de martillo en que no requiere un ion metálico para la reacción.

Función biológica

La ribozima en horquilla es un motivo de ARN que cataliza reacciones de procesamiento de ARN esenciales para la replicación de las moléculas de ARN satélite en las que está integrada. Estas reacciones son de autoprocesamiento, es decir, una molécula reorganiza su propia estructura. Tanto las reacciones de escisión como las de unión de extremos están mediadas por el motivo de la ribozima, lo que da lugar a una mezcla de moléculas de ARN satélite lineales y circulares interconvertibles. Estas reacciones son importantes para el procesamiento de las grandes moléculas de ARN multiméricas que se generan mediante la replicación en círculo rodante . Al final del ciclo de replicación, estos grandes intermediarios de la replicación del ARN satélite se procesan hasta convertirse en moléculas de longitud unitaria (circulares o lineales) antes de que puedan ser empaquetadas por virus y transportadas a otras células para rondas adicionales de replicación. [ 1 ]

Plegamiento de la ribozima en horquilla en su estructura terciaria nativa. La secuencia de la ribozima se muestra en gris, mientras que la secuencia del sustrato es de color rojo claro. El sitio de escisión y ligación (rojo oscuro) se encuentra entre los nucleótidos A-1 y G+1. Se muestran secuencias importantes dentro de los bucles A y B, con puntos negros que indican interacciones no Watson-Crick entre nucleótidos. Los dos nucleótidos catalíticos se muestran en verde, y el nucleótido crítico C25, que forma un par de bases Watson-Crick con G+1 en el sitio de reacción, se muestra en azul. [ 2 ]

Versiones naturales de la ribozima en horquilla

En la década de 1980, la ribozima en horquilla fue identificada en 3 secuencias naturales bien caracterizadas:

Trabajos posteriores de 2021 revelaron casi 1000 secuencias de ribozimas en horquilla en organismos en gran parte desconocidos, halladas en datos de metatranscriptoma . [ 7 ] Se planteó la hipótesis [ 7 ] de que estas secuencias más recientes se encuentran en organismos que, al igual que aquellos que contienen las tres ribozimas en horquilla encontradas previamente, utilizan genomas de ARN circular monocatenario . La circularidad de los genomas fue respaldada experimentalmente, pero la naturaleza de estos organismos aún no se ha estudiado en profundidad.

Versiones artificiales de la ribozima en horquilla

Se han desarrollado versiones artificiales más pequeñas de la ribozima en horquilla para permitir un análisis experimental más detallado de la molécula. [ 8 ] Esta es una estrategia comúnmente utilizada para separar las partes de una molécula de ARN de autoprocesamiento que son esenciales para las reacciones de procesamiento del ARN de aquellas partes que cumplen funciones no relacionadas. Mediante este proceso, se identificó un dominio catalítico mínimo de 50 nucleótidos y un sustrato de 14 nucleótidos. [ 9 ] Utilizando estas secuencias derivadas artificialmente, se desarrolló una ribozima transactiva que puede catalizar la escisión de múltiples moléculas de sustrato. Esta estrategia fue importante porque permitió a los investigadores (i) aplicar métodos bioquímicos para el análisis enzimático, (ii) realizar experimentos para identificar elementos estructurales esenciales del complejo ribozima-sustrato y (iii) desarrollar ribozimas modificadas que se han utilizado para aplicaciones biomédicas, incluyendo la prevención de la replicación de virus patógenos y el estudio de la función de genes individuales.

Química de reacciones

Al igual que otras ribozimas y ribonucleasas de proteínas, la reacción de escisión de la ribozima en horquilla genera fragmentos de ARN cuyos extremos constan de un fosfato cíclico 2',3' y un grupo hidroxilo 5'. La reacción de ligación parece ser una simple inversión de la escisión, es decir, la unión covalente de fragmentos de ARN que terminan en un fosfato cíclico 2',3' y un grupo hidroxilo 5' para generar el enlace fosfodiéster 3'-5' habitual presente tanto en el ARN como en el ADN.

Estudios de esta reacción en múltiples ribozimas han servido para establecer que la química de la reacción (mecanismo catalítico) es una propiedad endógena de la propia molécula de ARN y no está mediada por iones metálicos, como ocurre con algunas enzimas proteicas y otras ribozimas. [ 10 ] Además, la actividad de escisión se sigue observando cuando el Mg 2+ se reemplaza por [Co(NH 3 ) 6 ] 3+ . [ 11 ] El Co 3+ se une al NH 3 tan fuertemente en solución que el NH 3 no se disocia en una medida apreciable y, por lo tanto, no se protona. Esto sugiere que no hay transferencia de protones catalizada por metales ni coordinación directa al ARN, sino que los metales solo son necesarios para el plegamiento. Además, en las estructuras cristalinas de un complejo ribozima-inhibidor y un mimetizador del estado de transición , se demostró que la arquitectura tridimensional separa A-1 y G+1, posicionando el 2'-OH de A-1 para un ataque nucleofílico en línea sobre el enlace fosfato escindible. Adicionalmente, se ha sugerido que G8, A38 y A9 desempeñan funciones en la catálisis al desprotonar el 2'-OH de A-1, estabilizar la carga negativa que se desarrolla en los oxígenos fosfato pentacoordinados y protonar el grupo saliente 5'-O de G+1. [ 12 ] [ 13 ]

Estructura

Representación de la estructura 3D de la ribozima en horquilla. [ 14 ]

El complejo mínimo de ribozima en horquilla-sustrato se pliega en una estructura secundaria que incluye dos dominios, cada uno compuesto por dos hélices cortas apareadas de bases separadas por un bucle interno. El dominio A (hélice 1 – bucle A – hélice 2) contiene el sustrato y la región primaria de reconocimiento del sustrato de la ribozima. El dominio B (hélice 3 – bucle B – hélice 4) es más grande y contiene los determinantes catalíticos primarios de la ribozima. Los dos dominios están unidos covalentemente mediante un enlace fosfodiéster que conecta la hélice 2 con la hélice 3. Estos dominios deben interactuar entre sí para que se produzca la catálisis. [ 15 ]

Cuando se permite que el complejo mínimo ribozima-sustrato se pliegue en condiciones de baja fuerza iónica , los dos dominios se apilan uno encima del otro, formando una estructura extendida e inactiva que se asemeja a una horquilla. [ 16 ] Para que ocurra la catálisis, los dos dominios se disponen paralelamente entre sí en un pliegue que se asemeja a un clip. En varias publicaciones, este ARN ha sido denominado ribozima "clip" o "horquilla". A pesar de que el primer nombre ha demostrado ser más preciso, el segundo se ha convertido en la nomenclatura comúnmente aceptada. En el laboratorio, una interacción funcional entre los dos dominios se promueve mediante la adición de cationes , cuya carga positiva es suficiente para superar la repulsión electrostática del esqueleto de ARN cargado negativamente. En la naturaleza, la asociación de los dos dominios se ve facilitada por una combinación de iones metálicos (incluido Mg 2+ ) y la presencia de dos dominios helicoidales adicionales que no están presentes en el complejo mínimo ribozima-sustrato, pero que sirven para promover un plegamiento tridimensional adecuado. Estos dominios adicionales se apilan sobre las hélices 2 y 3, promoviendo así la asociación de los dos dominios funcionales a través de lo que se denomina una unión helicoidal de cuatro vías. [ 17 ]

La estructura y actividad de la ribozima en horquilla se han explorado mediante una amplia gama de métodos experimentales complementarios, que incluyen la sustitución de nucleótidos, la sustitución de grupos funcionales , la selección combinatoria, la espectroscopia de fluorescencia , el entrecruzamiento covalente , el análisis por RMN y la cristalografía de rayos X. Estos estudios se han visto facilitados por la capacidad del complejo funcional para autoensamblarse a partir de segmentos obtenidos mediante síntesis química de ARN en fase sólida , lo que permite la incorporación de una gran variedad de nucleótidos modificados que no se encuentran de forma natural en el ARN. En conjunto, los resultados de estos experimentos presentan una imagen altamente congruente del ciclo catalítico , es decir, cómo la ribozima en horquilla se une a su sustrato, se pliega en una estructura tridimensional específica, cataliza la reacción y libera el o los productos de la reacción. [ 18 ]

Escisión selectiva del ARN y actividad antiviral

Los ribozimas en horquilla se han modificado de tal manera que pueden utilizarse para dirigir la escisión de otras moléculas de ARN. Esto es posible porque gran parte de la especificidad del sustrato del ribozima en horquilla resulta del simple apareamiento de bases de Watson-Crick dentro de las hélices 1 y 2. [ 19 ]

Un área de particular interés ha sido el desarrollo de ribozimas en horquilla para su potencial uso terapéutico, por ejemplo, para prevenir la replicación de virus patógenos. Se han generado y expresado ribozimas en horquilla antivirales en células de mamíferos, y se ha demostrado que las células que expresan diferentes ribozimas modificadas son resistentes a la infección por VIH-1 , [ 20 ] [ 21 ] hepatitis B , [ 22 ] y virus Sindbis . [ 23 ]

Referencias

  1. ↑ Symons, RH (1997). "ARN patógenos de plantas y catálisis de ARN" . Nucleic Acids Res . 25 (14): 2683– 2689. doi : 10.1093/nar/25.14.2683 . PMC 146833. PMID 9207012 .  
  2. ↑ Alam, S.; Grum-Tokars, V.; Krucinska, J.; Kundracik, M.; Wedekind, J. (2005). "Heterogeneidad conformacional en la posición U37 de una ribozima de horquilla totalmente de ARN con implicaciones para la unión de metales y la estructura catalítica del giro S". Biochemistry . 44 (44): 14396– 14408. doi : 10.1021/bi051550i . PMID 16262240 . 
  3. ↑ Feldstein, PA; Buzayan, JM; Bruening, G (15 de octubre de 1989). "Dos secuencias que participan en el procesamiento autolítico del ARN complementario del virus satélite de la mancha anular del tabaco". Gene . 82 (1): 53– 61. doi : 10.1016/0378-1119(89)90029-2 . PMID 2583519 . 
  4. ↑ Hampel, A; Tritz, R (13 de junio de 1989). "Propiedades catalíticas del ARN de la secuencia mínima (-)sTRSV". Biochemistry . 28 (12): 4929– 4933. doi : 10.1021/bi00438a002 . PMID 2765519 . 
  5. ↑ Rubino, L; Tousignant, ME; Steger, G; Kaper, JM (septiembre de 1990). "Secuencia de nucleótidos y análisis estructural de dos ARN satélite asociados con el virus del moteado amarillo de la achicoria" . The Journal of General Virology . 71 (9): 1897–1903 . doi : 10.1099/0022-1317-71-9-1897 . PMID 1698918 . 
  6. ↑ Kaper, JM; Tousignant, ME; Steger, G (15 de julio de 1988). "La secuencia de nucleótidos predice la circularidad y la autocorte del satélite de 300 ribonucleótidos del virus del mosaico de la arabis". Biochemical and Biophysical Research Communications . 154 (1): 318– 325. Bibcode : 1988BBRC..154..318K . doi : 10.1016/0006-291x(88)90687-0 . PMID 3395334 . 
  7. 1 2 Weinberg CE, Olzog VJ, Eckert I, Weinberg Z (junio de 2021). "Identificación de más de 200 veces más ribozimas en horquilla de las que se conocían previamente en diversos ARN circulares" . Nucleic Acids Res . 49 (11): 6375– 6388. doi : 10.1093/nar/ gkab454 . PMC 8216279. PMID 34096583 .  
  8. ↑ Feldstein, PA; Bruening, G (1993). "Geometría catalíticamente activa en la circularización reversible de ARN 'minimonómeros' derivados de la cadena complementaria del ARN satélite del virus de la mancha anular del tabaco" . Nucleic Acids Research . 21 (8): 1991– 1998. doi : 10.1093 / nar/21.8.1991 . PMC 309442. PMID 7684131 .  
  9. ↑ Hampel, A; Tritz, R (1989). "Propiedades catalíticas del ARN de la secuencia mínima (-)sTRSV". Biochemistry . 28 (12): 4929– 4933. doi : 10.1021/bi00438a002 . PMID 2765519 . 
  10. ↑ Murray, JB; Seyhan, AA; Walter, NG; Burke, JM; Scott, WG (1998). "Las ribozimas cabeza de martillo, horquilla y VS son catalíticamente eficientes solo con cationes monovalentes" ( PDF) . Química y Biología . 5 (10): 587– 595. doi : 10.1016/S1074-5521(98)90116-8 . PMID 9818150. S2CID 17025877 .  
  11. ↑ Young, KJ; Gill, F.; Grasby, JA (1 de octubre de 1997). "Los iones metálicos desempeñan un papel pasivo en la reacción catalizada por la ribozima en horquilla" . Nucleic Acids Research . 25 (19): 3760– 3766. doi : 10.1093 / nar/25.19.3760 . ISSN 0305-1048 . PMC 146958. PMID 9380495 .   
  12. ↑ Rupert, PB; Ferré-D'Amaré, AR (12 de abril de 2001). "Estructura cristalina de un complejo inhibidor de ribozima en horquilla con implicaciones para la catálisis". Nature . 410 ( 6830): 780– 786. Bibcode : 2001Natur.410..780R . doi : 10.1038/35071009 . ISSN 0028-0836 . PMID 11298439. S2CID 4416839 .   
  13. ^ Ruperto, Peter B.; Massey, Archna P.; Sigurdsson, Snorri Th; Ferré-D'Amaré, Adrian R. (15 de noviembre de 2002). "Estabilización del estado de transición mediante un ARN catalítico". Ciencia . 298 (5597): 1421– 1424. Bibcode : 2002Sci...298.1421R . doi : 10.1126/ciencia.1076093 . ISSN 1095-9203 . PMID 12376595 . S2CID 23783258 .   
  14. ↑ Salter, J.; Krucinska, J.; Alam, S.; Grum-Tokars, V.; Wedekind, JE (2006). "Agua en el sitio activo de una ribozima de horquilla totalmente de ARN y los efectos de las variantes de la base Gua8 en la geometría de la transferencia de fosforilo" . Biochemistry . 45 ( 3): 686–700 . doi : 10.1021/bi051887k . PMC 2546605. PMID 16411744 .  
  15. ↑ Butcher, SE; Heckman, JE; Burke, JM (1995). "Reconstitución de la actividad de la ribozima en horquilla tras la separación de los dominios funcionales" . The Journal of Biological Chemistry . 270 (50): 29648– 29651. doi : 10.1074/jbc.270.50.29648 . PMID 8530348 . 
  16. ↑ Esteban, JA; Walter, NG; Kotzorek, G.; Heckman, JE; Burke, JM (1998). "Base estructural para la cinética heterogénea: Reingeniería de la ribozima en horquilla" (PDF) . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 95 ( 11): 6091– 6096. Bibcode : 1998PNAS...95.6091E . doi : 10.1073/pnas.95.11.6091 . PMC 27590. PMID 9600922 .  
  17. ↑ Nahas, M.; Wilson, TJ; Ha, T.; Lilley, DMJ (2005). "Plegamiento y catálisis de la ribozima en horquilla". Biochemical Society Transactions . 33 (Pt 3): 461– 465. doi : 10.1042/BST0330461 . PMID 15916541 . 
  18. ↑ Cochrane, JC; Strobel, SA (2008). "Estrategias catalíticas de ribozimas autoescindibles". Accounts of Chemical Research . 41 (8): 1027– 1035. doi : 10.1021/ar800050c . PMID 18652494 . 
  19. ↑ Chowrira, BM; Burke, JM (1991). "Unión y escisión de ácidos nucleicos por la ribozima "en horquilla"". Biochemistry . 30 (35): 8518– 8522. doi : 10.1021/bi00099a003 . PMID 1909564 . 
  20. ↑ Yu, M; Ojwang, J; Yamada, O; Hampel, A; Rapapport, J; Looney, D; Wong-Staal, F (1993). "Una ribozima en horquilla inhibe la expresión de diversas cepas del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 90 (13): 6340– 6344. Bibcode : 1993PNAS...90.6340Y . doi : 10.1073/pnas.90.13.6340 . PMC 46924. PMID 8327516 .  
  21. ↑ Puerta-Fernández E, Barroso-del Jesus A, Romero-López C, Tapia N, Martínez MA, Berzal-Herranz A (10 de junio de 2005). "Inhibición de la replicación del VIH-1 por ARN dirigido a la región LTR" . SIDA . 19 (9): 863– 870. doi : 10.1097/01.aids.0000171399.77500.e0 . PMID 15905666 . S2CID 16652577 .  
  22. ↑ Zu Putlitz, J.; Yu, Q.; Burke, JM; Wands, JR (1999). "Cribado combinatorio y actividad antiviral intracelular de ribozimas en horquilla dirigidas contra el virus de la hepatitis B" . Journal of Virology . 73 (7): 5381– 5387. doi : 10.1128/JVI.73.7.5381-5387.1999 . PMC 112594. PMID 10364285 .  
  23. ↑ Zhang, Z.; Burke, J. (2005). "Inhibición de la replicación viral por ribozima: análisis mutacional del sitio y mecanismo de la actividad antiviral" . Journal of Virology . 79 (6): 3728– 3736. doi : 10.1128/JVI.79.6.3728-3736.2005 . PMC 1075678. PMID 15731266 .  

Lecturas adicionales

  • Doherty, EA; Doudna JA (2001). "Estructuras y mecanismos de las ribozimas". Annu Rev Biophys Biomol Struct . 30 : 457–475 . doi : 10.1146/annurev.biophys.30.1.457 . PMID 11441810 . 
  • Ferré-D'Amaré, AR; Rupert PB (2002). "La ribozima en horquilla: de la estructura cristalina a la función". Biochem Soc Trans . 30 (Pt 6): 1105–1109 . doi : 10.1042/BST0301105 . PMID 12440983. S2CID 32576742 .  
  • Página sobre ribozimas en horquilla en Rfam
  • Página de Hairpin-meta1 en Rfam
  • Página de Hairpin-meta2 en Rfam