Amplificación dependiente de helicasa

La amplificación dependiente de helicasa (HDA) es un método para la amplificación de ADN in vitro (similar a la reacción en cadena de la polimerasa ) que se lleva a cabo a temperatura constante.

La reacción en cadena de la polimerasa es el método más utilizado para la amplificación de ADN in vitro con fines de biología molecular e investigación biomédica. ^{[ 1 ]} Este proceso implica la separación del ADN de doble cadena en cadenas simples a alta temperatura (el paso de desnaturalización, que generalmente se logra a 95–97  °C), la hibridación de los cebadores al ADN de cadena simple (el paso de hibridación) y la copia de las cadenas simples para crear nuevo ADN de doble cadena (el paso de extensión que requiere la ADN polimerasa) requiere que la reacción se realice en un termociclador . Estas máquinas de sobremesa son grandes, caras y costosas de operar y mantener, lo que limita las posibles aplicaciones de la amplificación de ADN en situaciones fuera del laboratorio (por ejemplo, en la identificación de microorganismos potencialmente peligrosos en el lugar de la investigación o en el punto de atención de un paciente). Aunque la PCR generalmente se asocia con el ciclo térmico, la patente original de Mullis et al. ^{[ 2 ]} reveló el uso de una helicasa como medio para la desnaturalización del ADN de doble cadena, incluyendo así la amplificación isotérmica de ácidos nucleicos . In vivo , el ADN es replicado por ADN polimerasas con varias proteínas accesorias, incluyendo una helicasa de ADN que actúa para separar el ADN desenrollando la doble hélice del ADN. ^{[ 3 ]} La HDA se desarrolló a partir de este concepto, utilizando una helicasa (una enzima ) para desnaturalizar el ADN.

Las hebras de ADN de doble cadena se separan primero mediante una helicasa de ADN y se recubren con proteínas de unión a ADN de cadena simple (ADNmc). En el segundo paso, dos cebadores específicos de secuencia se hibridan en cada borde de la plantilla de ADN. A continuación, se utilizan polimerasas de ADN para extender los cebadores hibridados a las plantillas y producir ADN de doble cadena. Los dos productos de ADN recién sintetizados se utilizan como sustratos por las helicasas de ADN, entrando así en la siguiente ronda de la reacción. De este modo, se desarrolla una reacción en cadena simultánea, que da como resultado una amplificación exponencial de la secuencia diana seleccionada (véase Vincent et al. , 2004 ^{[ 4 ]} para un diagrama esquemático).

Desde la publicación de su descubrimiento, la tecnología HDA se ha utilizado para una " prueba de ácido nucleico simple y fácil de adaptar para la detección de Clostridioides difficile ". ^{[ 5 ]} Otras aplicaciones incluyen la detección rápida de Staphylococcus aureus mediante la amplificación y detección de una secuencia corta de ADN específica de la bacteria. ^{[ 6 ]} Las ventajas de HDA radican en que proporciona un método rápido de amplificación de ácido nucleico de un objetivo específico a temperatura isotérmica que no requiere un termociclador. Sin embargo, el investigador debe optimizar previamente los cebadores y, en ocasiones, los tampones. Normalmente, la optimización de los cebadores y los tampones se prueba y se logra mediante PCR, lo que plantea la cuestión de la necesidad de invertir en un sistema aparte para realizar la amplificación propiamente dicha. A pesar de la ventaja de que HDA elimina el uso de un termociclador y, por lo tanto, permite realizar investigaciones en el campo, gran parte del trabajo necesario para detectar microorganismos potencialmente peligrosos se lleva a cabo en un laboratorio de investigación u hospitalario. Actualmente, el diagnóstico masivo a partir de un gran número de muestras aún no es posible con HDA, mientras que las reacciones de PCR realizadas en termocicladores que admiten placas de muestras de múltiples pocillos permiten la amplificación y detección del ADN objetivo deseado a partir de un máximo de 96 muestras. El costo de los reactivos para HDA también es relativamente elevado en comparación con el de los reactivos para PCR, sobre todo porque se suministra en forma de kit listo para usar.

• Sitio web oficial de Biohelix Corporation