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Cromatografía de capa fina de alto rendimiento

Imagen de una placa HPTLC para identificar diferentes sustancias dentro de una muestra. La cromatografía de capa fina de alto rendimiento ( HPTLC ) sirve como una extensión de l...

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Imagen de una placa HPTLC para identificar diferentes sustancias dentro de una muestra.

La cromatografía de capa fina de alto rendimiento ( HPTLC ) sirve como una extensión de la cromatografía de capa fina (TLC), ofreciendo robustez, simplicidad, velocidad y eficiencia en el análisis cuantitativo de compuestos. [ 1 ] Esta técnica analítica basada en TLC mejora la resolución de compuestos para el análisis cuantitativo. Algunas de estas mejoras implican el empleo de placas de TLC de mayor calidad con tamaños de partícula más finos en la fase estacionaria, lo que conduce a una mejor resolución. [ 2 ] Además, la separación se puede refinar aún más mediante el desarrollo repetido de la placa utilizando un dispositivo de desarrollo múltiple. Como resultado, la HPTLC proporciona una resolución superior y límites de detección (LOD) más bajos. [ 3 ]

Instrumentación

Ventajas de HPTLC [ 1 ]

  • Proporciona información clara y concisa sobre los efectos derivados de compuestos individuales en muestras complejas o naturales separadas en paralelo.
  • Combina la separación cromatográfica con la detección dirigida por efectos mediante ensayos enzimáticos o biológicos.
  • Ayuda a seleccionar compuestos importantes de una muestra para su posterior caracterización mediante espectrometría de masas de alta resolución.
  • Ofrece ventajas únicas como la superhibridación, requisitos mínimos de preparación de muestras, detección de compuestos multimoduladores y la distinción entre efectos agonistas y antagonistas.

Modo

La HPTLC comprende tres modos: lineal, circular y anticircular. Entre estos modos, el anticircular destaca como el más rápido, tanto en teoría como en la práctica, dentro del ámbito de la HPTLC. Este modo logra la separación permitiendo que la fase móvil entre en la placa con precisión a lo largo de una trayectoria circular exterior, tras lo cual fluye hacia el centro a una velocidad casi constante. Este enfoque maximiza la capacidad de muestra a la vez que minimiza el tiempo, el consumo de capas y de fase móvil, lo que la convierte en la técnica de HPTLC más rentable. La estrecha trayectoria del punto, característica de la HPTLC anticircular, facilita la cuantificación automatizada. En comparación con los modos lineal y circular, el modo anticircular demuestra una separación superior y una sensibilidad significativamente mayor, especialmente a valores de Rf más altos. [ 2 ]

Metodología

Para comenzar con la HPTLC, es necesario determinar una fase estacionaria que permita separar los diferentes compuestos de una mezcla. Alrededor del 90 % de las separaciones farmacéuticas se realizan en gel de sílice de fase normal; sin embargo, se pueden utilizar otras fases estacionarias, como la alúmina, para muestras con compuestos disociables y la celulosa para compuestos iónicos. [ 4 ] El método de HPTLC de fase inversa (metodología similar a la TLC de fase inversa) se utiliza para compuestos de alta polaridad. Tras la selección de la fase estacionaria, las placas se lavan generalmente con metanol y se secan en un horno para eliminar el exceso de disolvente. [ 5 ]

La selección de la fase móvil es uno de los procesos más importantes de la HPTLC y sigue un método de ensayo y error. Sin embargo, el sistema PRISMA sirve como guía para encontrar la fase móvil óptima. [ 1 ] La fase móvil depende de la absortividad de la fase estacionaria y de la composición del compuesto de interés. [ 5 ] El compuesto se prueba primero con soluciones como éter dietílico , etanol , diclorometano y cloroformo para HPTLC de fase normal, o soluciones como metanol , acetonitrilo y tetrahidrofurano para HPTLC de fase inversa. A continuación, se analizan los factores de retardo ( R f) de los compuestos con el disolvente seleccionado y se elige como fase móvil aquel que proporciona el mayor R f. Posteriormente, se prueba la fuerza del disolvente móvil frente al hexano (para HPTLC normal) y el agua (para HPTLC de fase inversa) para determinar si es necesario realizar ajustes. [ 5 ] [ 6 ]

Máquina CAMAG HPTLC

Dispositivos HPTLC notables como el Linomat 5 y el Automatic TLC Sampler 4 (ATS 4) de CAMAG funcionan de manera muy similar al tener la técnica automatizada de aplicación de muestra por "pulverización". [ 4 ] [ 5 ] Esta técnica automatizada de "pulverización" es útil para superar la incertidumbre en el tamaño y la posición de las gotas cuando la muestra se aplica a la placa TLC manualmente. Además, la automatización proporciona alta resolución y bandas estrechas ya que el solvente se evapora inmediatamente cuando la muestra entra en contacto con la placa. [ 4 ] Un enfoque para la automatización ha sido el uso de dispositivos piezoeléctricos e impresoras de inyección de tinta para aplicar la muestra. [ 7 ] Alternativamente, el Nanomat 4 y el ATS 4 de CAMAG se operan manualmente donde la muestra se aplica mediante aplicación puntual usando una pipeta capilar. [ 4 ] [ 5 ]

En la detección cromatográfica, las placas HPTLC se desarrollan generalmente en cámaras de doble cubeta saturadas con papel de filtro para obtener resultados óptimos. [ 5 ] [ 6 ] Sin embargo, también se utilizan cámaras de fondo plano y cámaras de desarrollo horizontal para compuestos específicos. El mecanismo general del dispositivo HPTLC es el siguiente: [ 5 ] Se coloca un papel de filtro ajustado en la cubeta trasera de la cámara y se vierte la fase móvil a través de la cubeta trasera para asegurar la absorción completa del solvente por el papel de filtro. Luego, la cámara se inclina a ~45° para que ambas cubetas tengan el mismo volumen de solvente y se deja equilibrar durante ~20 minutos. [ 5 ] Finalmente, la placa HPTLC se coloca en la cámara para su desarrollo. Entre cada lectura de muestra, se cambian la fase móvil y el papel de filtro para asegurar los mejores resultados.

La capacidad de detección (análoga a la capacidad de pico en HPLC ) puede incrementarse mediante el desarrollo de la placa con dos disolventes diferentes, utilizando cromatografía bidimensional . [ 8 ] El procedimiento comienza con el desarrollo de una placa cargada con la muestra utilizando el primer disolvente. Tras retirarla, la placa se gira 90° y se desarrolla con un segundo disolvente.

Aplicaciones

La HPTLC tiene una amplia aplicación en diversos campos, como la industria farmacéutica, la química clínica, la química forense, la bioquímica, la cosmetología, el análisis de alimentos y medicamentos, el análisis ambiental y muchos más, gracias a sus numerosas ventajas. Se distingue por ser el único método cromatográfico capaz de presentar los resultados en forma de imágenes y ofrece simplicidad, rentabilidad, análisis paralelo de muestras, alta capacidad de análisis, resultados rápidos y la opción de utilizar múltiples métodos de detección.

El equipo de investigación de Le Roux evaluó la HPTLC para determinar los niveles séricos de salbutamol en ensayos clínicos y concluyó que es un método adecuado para analizar muestras de suero. [ 3 ]

La HPTLC ha demostrado ser valiosa en liquenología para el análisis e identificación de sustancias liquénicas . En comparación con la TLC estándar, esta técnica ofrece varias ventajas para el cribado de compuestos liquénicos: permite analizar el doble de muestras en una placa, requiere significativamente menos disolvente (4 ml por placa frente a 250 ml), completa la separación cromatográfica en menos de 10 minutos por placa y puede detectar sustancias a concentraciones mucho más bajas. La mayor sensibilidad del método ha permitido la detección de compuestos liquénicos previamente no identificados y ha revelado una mayor variación química dentro de las especies de líquenes. Desde principios de la década de 1990, la HPTLC se ha utilizado como una alternativa mejorada a la TLC estándar para el cribado rutinario de sustancias liquénicas, aunque el secado adecuado de la placa es fundamental, ya que la técnica es más sensible a la humedad atmosférica que la TLC estándar. [ 9 ]

La HPTLC también se ha utilizado con éxito en la separación de diversas subclases de lípidos, obteniéndose resultados reproducibles y prometedores para 20 subclases diferentes. Se han publicado numerosos informes relacionados con estudios de medicina clínica en diversas revistas. En consecuencia, la HPTLC se recomienda encarecidamente para el análisis de fármacos en suero y otros tejidos. [ 7 ]

Referencias

  1. 1 2 3 Morlock, Gertrud E. (2 de octubre de 2021). "Cromatografía de capa fina de alto rendimiento combinada con ensayos dirigidos por efectos y espectrometría de masas de alta resolución como una tecnología híbrida emergente: una revisión tutorial" . Analytica Chimica Acta . 1180 338644. Bibcode : 2021AcAC.118038644M . doi : 10.1016/j.aca.2021.338644 . ISSN 0003-2670 . PMID 34538319. S2CID 236348479 .   
  2. 1 2 Kaiser, RE (septiembre de 1978). "Cromatografía de capa fina de alto rendimiento anticircular" . Journal of High Resolution Chromatography . 1 (3): 164– 168. doi : 10.1002/jhrc.1240010309 . ISSN 0935-6304 . 
  3. 1 2 Le Roux, AM; Wium, CA; Joubert, JR; Van Jaarsveld, PP (octubre de 1992). "Evaluación de una técnica cromatográfica de capa fina de alto rendimiento para la determinación de los niveles séricos de salbutamol en ensayos clínicos". Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications . 581 (2): 306– 309. doi : 10.1016/0378-4347(92)80288-2 . ISSN 0378-4347 . PMID 1452625 .  
  4. 1 2 3 4 Shewiyo, DH; Kaale, E.; Risha, PG; Dejaegher, B.; Smeyers-Verbeke, J.; Heyden, Y. Vander (1 de julio de 2012). "Métodos HPTLC para analizar ingredientes activos en formulaciones farmacéuticas: una revisión de los pasos de desarrollo y validación del método" . Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis . 66 : 11–23 . doi : 10.1016/j.jpba.2012.03.034 . ISSN 0731-7085 . PMID 22494517 .  
  5. 1 2 3 4 5 6 7 8 Patel, Rashmin B.; Patel, Mrunali R.; Batel, Bharat G. (2011), "Aspectos experimentales e implementación de HPTLC", en Srivastava, ManMohan (ed.), Cromatografía de capa fina de alto rendimiento (HPTLC) , Berlín, Heidelberg: Springer, pp. 41–54 , Bibcode : 2011htc..book...41P , doi : 10.1007/978-3-642-14025-9_3 , ISBN  978-3-642-14025-9
  6. 1 2 Sherma, Joseph (1 de mayo de 2010). "Revisión de HPTLC en el análisis de fármacos: 1996-2009" . Journal of AOAC International . 93 (3): 754– 764. doi : 10.1093/jaoac/93.3.754 . ISSN 1060-3271 . PMID 20629372. Recuperado el 6 de noviembre de 2023 .  
  7. 1 2 Bernardi, Tatiana; Tamburini, Elena (octubre de 2009). "Un método HPTLC-AMD para comprender el comportamiento metabólico de microorganismos en presencia de fuentes mixtas de carbono. El caso de Bifidobacterium adolescenteis MB 239". Revista de cromatografía plana - TLC moderna . 22 (5): 321– 325. doi : 10.1556/jpc.22.2009.5.2 . ISSN 0933-4173 . S2CID 86407898 .  
  8. ↑ Nurok, David (1 de marzo de 1989). "Estrategias para optimizar la fase móvil en cromatografía planar" . Chemical Reviews . 89 (2): 363–375 . doi : 10.1021/cr00092a007 . ISSN 0009-2665 . 
  9. ↑ Arup, Ulf; Ekman, Stefan; Lindblom, Louise; Mattsson, Jan-Eric (1993). "Cromatografía de capa fina de alto rendimiento (HPTLC), una técnica mejorada para el análisis de sustancias liquénicas". The Lichenologist . 25 (1): 61– 71. Bibcode : 1993ThLic..25...61A . doi : 10.1006/lich.1993.1018 .
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