microscopía de interferencia holográfica

La microscopía de interferencia holográfica ( HIM ) es una técnica de interferometría holográfica aplicada a la microscopía para la visualización de microobjetos de fase . Estos microobjetos son invisibles porque no modifican la intensidad de la luz, sino que solo introducen cambios de fase imperceptibles. La microscopía de interferencia holográfica se distingue de otros métodos de microscopía por el uso de un holograma y la interferencia para convertir estos cambios de fase imperceptibles en variaciones de intensidad .

Otros métodos de microscopía relacionados con la microscopía de interferencia holográfica son la microscopía de contraste de fase y la interferometría holográfica.

La holografía nació como un "nuevo principio de microscopía". D. Gabor inventó la holografía para la microscopía electrónica . Por alguna razón, su idea no se aplica en esta rama de la microscopía . Pero la invención de la holografía abrió nuevas posibilidades en la obtención de imágenes de microobjetos de fase debido a la aplicación de métodos de interferencia holográfica en microscopía que permiten no solo el estudio cualitativo, sino también el cuantitativo. La combinación de la microscopía de interferencia holográfica con métodos de procesamiento numérico ha resuelto el problema de la obtención de imágenes 3D de microobjetos biológicos de fase nativos no tratados. ^{[ 1 ] [ 2 ] [ 3 ]}

En el método de interferencia holográfica, las imágenes aparecen como resultado de la interferencia de dos ondas de objeto que recorren la misma trayectoria a través del sistema óptico del microscopio, pero en diferentes instantes: la onda de objeto "vacía" reconstruida a partir del holograma y la onda de objeto perturbada por los microobjetos de fase en estudio. El holograma de la onda de objeto "vacía" se registra mediante un haz de referencia y se utiliza como elemento óptico del microscopio de interferencia holográfica. Según las condiciones de la interferencia, se pueden realizar dos métodos de microscopía de interferencia holográfica: el método de contraste de fase holográfico y el método de contraste de interferencia holográfico. En el primer caso, los desfases introducidos por el microobjeto de fase en la onda de luz que lo atraviesa se convierten en cambios de intensidad en su imagen; y en el segundo caso, en desviaciones de las franjas de interferencia.

El método de contraste de fase holográfico es una técnica de microscopía de interferencia holográfica para la visualización de microobjetos de fase que convierte los cambios de fase introducidos por el microobjeto en la onda de luz que lo atraviesa en cambios de intensidad en la imagen. El método se basa en la suma holográfica ( interferencia constructiva ) o la sustracción holográfica ( interferencia destructiva ) de la onda "vacía" reconstruida a partir del holograma y la onda del objeto perturbada por los microobjetos de fase en estudio. La imagen puede considerarse como un interferograma con franjas de interferencia de ancho infinito.

Este método resuelve el mismo problema que el método de contraste de fase de F. Zernike. Sin embargo, en comparación con este último, presenta algunas ventajas. Debido a la igualdad de intensidad de las ondas interferentes, el método de contraste de fase holográfico permite obtener imágenes con el máximo contraste . El tamaño del microobjeto no limita su aplicación, aunque el método de contraste de fase de F. Zernike funciona mejor cuanto menor sea el tamaño y el grosor del microobjeto. La imagen obtenida mediante el método de contraste de fase holográfico es el resultado de la interacción de dos ondas idénticas y está libre de aberraciones .

El método se puede implementar como un método de suma y resta holográfica en una franja de interferencia . Se introduce un pequeño ángulo entre las ondas que interfieren, de modo que el período del sistema resultante de franjas de interferencia supere significativamente el tamaño de las imágenes. Las condiciones para que las ondas estén en contrafase o en fase (sustracción o suma holográfica) se crean automáticamente dentro de franjas de interferencia oscuras y brillantes, respectivamente.

Las intensidades en la imagen del microobjeto${\displaystyle I_{im+}}$y la intensidad del fondo${\displaystyle I_{b+}}$En el caso de la suma de ondas en una franja de interferencia brillante, se determinan mediante las expresiones:

${\displaystyle I_{im+}(x',y')=2I_{0}[1+cosf(x,y)]}$;${\displaystyle I_{b+}=4I_{0}}$

y las intensidades en la imagen del microobjeto${\displaystyle I_{im-}}$y la intensidad del fondo${\displaystyle I_{b-}}$en el caso de sustracción de ondas en la franja de interferencia oscura (las ondas están en contrafase):

${\displaystyle I_{im-}(x',y')=2I_{0}[1-cosf(x,y)]}$; ${\displaystyle I_{b-}=0}$

dónde${\displaystyle f(x,y)}$es el desfase introducido por el microobjeto en la onda transmitida a través de él;${\displaystyle I_{0}}$es la intensidad de cada una de las dos ondas. Así, se pueden observar imágenes oscuras de microobjetos de fase sobre un fondo brillante en el caso de la suma de ondas, e imágenes brillantes sobre un fondo oscuro en el caso de la sustracción de ondas. El contraste de las imágenes es máximo.

La distribución de intensidad en las imágenes depende de los desfases introducidos por los microobjetos estudiados. Por lo tanto, el método permite medir los desfases y reconstruir imágenes 3D de los microobjetos mediante el procesamiento informático de sus imágenes de contraste de fase.

La alta sensibilidad a las vibraciones es la principal característica de este método. Requiere desarrollar el holograma en su lugar. Por lo tanto, el método sigue siendo "exótico" y no se aplica de forma generalizada.

El método de interferencia-contraste holográfico es una técnica de microscopía de interferencia holográfica para la visualización de microobjetos de fase que convierte los desplazamientos de fase introducidos por el microobjeto en la onda de luz transmitida en desviaciones de franjas de interferencia en su imagen. Se introduce un cierto ángulo entre la onda "vacía" y la onda perturbada por los microobjetos de fase, obteniéndose así un sistema de franjas de interferencia rectas, que se desvían en la imagen del microobjeto. La imagen puede considerarse como un interferograma en las franjas de ancho finito. La desviación${\displaystyle h(x',y')}$La amplitud de la franja de interferencia en un punto de la imagen depende linealmente del desfase.${\displaystyle f(x,y)}$insertado en el punto correspondiente del microobjeto:

${\displaystyle h(x',y')=f(x,y)T/2\pi }$,

dónde${\displaystyle T}$es el período establecido del sistema de franjas de interferencia. Así, la imagen de contraste de interferencia ( interferograma ) visualiza la silueta de fase del microobjeto en forma de líneas desviadas; y los desplazamientos de fase se pueden medir simplemente con una regla. Esto permite calcular el espesor óptico del microobjeto en cada punto. El método permite medir el espesor del microobjeto si se conoce su índice de refracción , o medir su índice de refracción si se conoce el espesor. Si el microobjeto tiene una distribución homogénea del índice de refracción , es posible reconstruir su forma física 3D mediante el procesamiento digital de las imágenes.

Este método puede utilizarse con microobjetos gruesos y delgados, pequeños y grandes. Gracias a la igualdad de intensidad de las ondas interferentes, el contraste de las imágenes es máximo. La onda "vacía" reconstruida a partir del holograma es una réplica de la onda del objeto. Por lo tanto, debido a la interferencia de ondas idénticas , se compensan las aberraciones ópticas del sistema óptico y las imágenes quedan libres de ellas.

Ambos métodos de microscopía de interferencia holográfica pueden implementarse en un solo dispositivo. El microscopio de interferencia holográfica utiliza un microscopio óptico en una configuración holográfica convencional fuera del eje, con la onda de referencia, habitual en holografía , un láser como fuente de luz coherente y el holograma. La onda del objeto "vacío", producida por el objetivo en ausencia de los microobjetos en estudio, se registra en el holograma utilizando la onda de referencia. El holograma desarrollado se devuelve a su posición original y funciona como un elemento óptico fijo del microscopio de interferencia holográfica. Las imágenes aparecen bajo la observación simultánea de la onda del objeto real perturbada por el microobjeto y la onda del objeto "vacío" reconstruida a partir del holograma. El período de la imagen de interferencia observada se ajusta simplemente desplazando el holograma desde su posición inicial.

El fundamento principal de los métodos HIM son el ruido coherente y la estructura de moteado de las imágenes que aparecen como resultado del uso de una fuente de luz coherente.

Los métodos de microscopía de interferencia holográfica se desarrollaron y aplicaron para el estudio de microobjetos de fase en la década de 1980. ^{[ 4 ] [ 5 ] [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ]}

A finales de la década de 1990, se empezó a utilizar un ordenador para la obtención de imágenes 3D de microobjetos de fase mediante sus interferogramas. Las imágenes 3D se obtuvieron por primera vez al investigar los eritrocitos sanguíneos. ^{[ 9 ]} Desde principios del siglo XXI, la microscopía de interferencia holográfica se ha convertido en microscopía de interferencia holográfica digital.

La microscopía de interferencia holográfica digital ( DHIM ) combina la microscopía de interferencia holográfica con métodos digitales de procesamiento de imágenes para la obtención de imágenes 3D de microobjetos de fase. Las imágenes holográficas de contraste de fase o de contraste de interferencia (interferogramas) se registran mediante una cámara digital, a partir de la cual un ordenador reconstruye imágenes 3D utilizando algoritmos numéricos .

El método más cercano a la microscopía de interferencia holográfica digital es la microscopía holográfica digital . Ambos métodos resuelven el mismo problema de obtención de imágenes 3D de microobjetos. Ambos utilizan la onda de referencia para obtener información de fase. La microscopía de interferencia holográfica digital es un método más "óptico". Esto la hace más evidente y precisa, ya que utiliza algoritmos numéricos claros y sencillos. La microscopía holográfica digital es un método más "digital". No es tan evidente; la aplicación de algoritmos numéricos aproximados complejos no permite alcanzar la precisión óptica.

La microscopía de interferencia holográfica digital permite la obtención de imágenes 3D y el estudio cuantitativo no invasivo de microobjetos biomédicos, como las células de un organismo. El método se ha utilizado con éxito para el estudio de la morfología 3D de los eritrocitos sanguíneos en diferentes enfermedades; ^{[ 10 ] [ 11 ] [ 12 ] [ 13 ]} para estudiar cómo la terapia con ozono afecta la forma de los eritrocitos, ^{[ 14 ]} para estudiar la alteración de la forma 3D de los eritrocitos sanguíneos en un paciente con anemia falciforme cuando se redujo la concentración de oxígeno en sangre, y el efecto de la radiación gamma en una dosis superletal sobre la forma de los eritrocitos de rata. ^{[ 15 ]}

El método puede utilizarse para medir el espesor de películas delgadas transparentes, cristales y/o para obtener imágenes 3D de sus superficies para el control de calidad. ^{[ 16 ] [ 17 ] [ 18 ]}

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