Yo-creo

I-CreI es una endonucleasa homing cuyo gen fue descubierto por primera vez en el genoma del cloroplasto de Chlamydomonas reinhardtii , una especie de alga verde unicelular . ^{[ 1 ]} Recibe su nombre por los siguientes hechos: reside en un intrón ; fue aislado de C. reinhardtii ; fue el primer ( I ) gen de este tipo aislado de C. reinhardtii . Su gen reside en un intrón del grupo I en el gen del ARN ribosómico 23S del cloroplasto de C. reinhardtii , e I - CreI solo se expresa cuando su ARNm es empalmado del transcrito primario del gen 23S. La enzima I-CreI , que funciona como un homodímero , reconoce una secuencia de 22 nucleótidos de ADN dúplex y escinde un enlace fosfodiéster en cada hebra en posiciones específicas. I-CreI pertenece a la familia LAGLIDADG de endonucleasas de homing, todas las cuales poseen un motivo de aminoácidos LAGLIDADG conservado que contribuye a sus dominios asociativos y sitios activos. Cuando el intrón que contiene I-CreI encuentra un alelo 23S que carece de él, la enzima I-CreI se dirige al alelo 23S "sin intrón" e introduce su intrón parental en dicho alelo. Los intrones con este comportamiento se denominan intrones móviles . Dado que I-CreI se propaga por sí misma sin conferir ningún beneficio a su huésped, es un ejemplo de ADN egoísta .

I-CreI se observó por primera vez como una secuencia interviniente en el gen del ARNr 23S del genoma del cloroplasto de C. reinhardtii . ^{[ 1 ]} El gen 23S es un gen de ARN , lo que significa que su transcrito no se traduce en proteína. Como ARN, forma parte de la subunidad grande del ribosoma . Se encontró un marco de lectura abierto que codifica una proteína de 163 aminoácidos en este intrón 23S, lo que sugiere que una proteína podría facilitar el comportamiento de localización del intrón móvil. Además, la proteína predicha tenía un motivo LAGLIDADG, una secuencia de aminoácidos conservada que está presente en otras proteínas codificadas en intrones móviles del grupo I. Un estudio de 1991 estableció que el ORF codifica una endonucleasa de ADN, I-CreI, que corta selectivamente un sitio correspondiente a donde el intrón se empalma fuera del transcrito primario 23S. ^{[ 2 ]} El estudio también mostró que el intrón era capaz de invadir alelos 23S que no lo tenían previamente. ^{[ 2 ]}

La enzima I-CreI ha evolucionado para cortar una secuencia de ADN de 22 nucleótidos que se encuentra en los alelos del gen del ARN ribosómico 23S que carecen del intrón que contiene I-CreI. Cuando se corta un alelo "sin intrón", se activan en la célula las vías de reparación de roturas de doble cadena . La célula utiliza como plantilla para la reparación el alelo 23S que produjo la enzima I-CreI responsable, replicando así el intrón que contiene I-CreI. ^{[ 3 ]} El alelo resultante "con intrón" ya no contiene un sitio de inserción intacto para la enzima I-CreI y, por lo tanto, no se corta. Dado que este intrón permite su propia replicación sin conferir ningún beneficio a su huésped, I-CreI es una forma de ADN egoísta .

Debido a que I-CreI ha evolucionado para cortar una secuencia de ADN tan larga, a diferencia de las endonucleasas de restricción que normalmente cortan secuencias de cuatro o seis nucleótidos, es capaz de cortar un único sitio dentro de un genoma muy grande . Se espera que una secuencia de cuatro o seis nucleótidos aparezca muchísimas veces en un genoma de millones o miles de millones de nucleótidos simplemente por casualidad, mientras que una secuencia de 22 nucleótidos podría aparecer solo una vez (10⁹ ^/ 4⁶ ^frente a ^10⁹ / ^4²² ). Esta especificidad de la escisión de I-CreI la convierte en una herramienta prometedora para la manipulación genética . Si una persona tuviera una enfermedad debido a un alelo defectuoso de algún gen , sería útil poder reemplazar ese alelo por uno funcional. Si se pudiera hacer que I-CreI cortara el ADN solo en el alelo defectuoso, proporcionando simultáneamente un alelo normal para que la célula lo utilizara como plantilla de reparación, la propia maquinaria de recombinación homóloga del paciente podría insertar el alelo deseado en lugar del disfuncional. La especificidad de I-CreI también permite reducir los efectos perjudiciales debidos a roturas de doble cadena fuera del gen de interés.

Para utilizar I-CreI como herramienta de esta manera, es necesario que reconozca y corte secuencias de ADN diferentes de su sitio de homing nativo. En 1997 se creó un sistema genético de Escherichia coli para estudiar la relación entre la estructura de I-CreI y su especificidad de sitio de homing. ^{[ 5 ]} En 1997, se determinó la estructura de la proteína I-CreI, ^{[ 6 ]} y en 1998, se resolvió su estructura cristalina unida a su sitio de homing de ADN nativo, lo que facilitó enormemente la investigación para alterar el reconocimiento del sitio de homing de la proteína. ^{[ 4 ]} Desde entonces, se han creado formas mutantes de la proteína que exhiben una especificidad de sitio de homing alterada. ^{[ 7 ] [ 8 ] [ 9 ]} También se ha creado un sistema genético en Saccharomyces cerevisiae , que ha producido mutantes adicionales de I-CreI con especificidades de sitio de homing modificadas. ^{[ 10 ] [ 11 ]}

La enzima I-CreI ya se ha utilizado con éxito para inducir la recombinación homóloga en Drosophila melanogaster , un organismo modelo eucariota extremadamente popular . ^{[ 12 ]} Parece muy probable que los avances en las técnicas de biología molecular y la generación de una biblioteca de nuevas endonucleasas derivadas de I-CreI permitan, con el tiempo, la focalización de muchos genes de importancia etiológica.