Inmunoensayo

Posiblemente una de las etiquetas más populares para usar en inmunoensayos sea "enzimas" . Los inmunoensayos que emplean enzimas se denominan inmunoensayos enzimáticos (EIA), de los cuales los ensayos inmunoenzimáticos (ELISA) y la técnica de inmunoensayo enzimático multiplicado (EMIT) son los tipos más comunes.

Las enzimas utilizadas en los ELISA incluyen la peroxidasa de rábano picante (HRP), la fosfatasa alcalina (AP) o la glucosa oxidasa . Estas enzimas permiten la detección a menudo porque producen un cambio de color observable en presencia de ciertos reactivos. En algunos casos, estas enzimas se exponen a reactivos que provocan la emisión de luz o quimioluminiscencia. Existen varios tipos de ELISA: directo, indirecto, sándwich y competitivo. ^{[ 7 ]}

Los isótopos radiactivos pueden incorporarse a los reactivos de inmunoensayo para producir un radioinmunoensayo (RIA). La radiactividad emitida por los complejos anticuerpo-antígeno unidos puede detectarse fácilmente mediante métodos convencionales.

Los RIA fueron algunos de los primeros inmunoensayos desarrollados, pero han caído en desuso debido principalmente a la dificultad y los peligros potenciales que presenta trabajar con radiactividad. ^{[ 8 ] [ 9 ]}

Un enfoque más reciente para los inmunoensayos consiste en combinar la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) con técnicas de inmunoensayo tradicionales. Denominada PCR inmunocuantitativa en tiempo real (iqPCR), la sonda utilizada en estos ensayos es una sonda de ADN . ^{[ 10 ] [ 11 ]}

Otro enfoque que utiliza marcadores de ADN es la plataforma de inmunoensayo multiplex NULISA, diseñada para detectar proteínas a niveles inferiores a pg/mL (fg/mL). Esta tecnología emplea un mecanismo secuencial de captura y liberación de inmunocomplejos, combinado con una lectura mediante secuenciación de nueva generación. Según una investigación publicada en Nature Communications , la plataforma es capaz de realizar multiplexación desde un único objetivo hasta cientos de objetivos en una sola muestra. ^{[ 12 ] [ 13 ]}

Los marcadores fluorogénicos como la ficoeritrina se utilizan en varios inmunoensayos modernos. ^{[ 14 ]} Los microarrays de proteínas son un tipo de inmunoensayo que a menudo emplea marcadores fluorogénicos. ^{[ 15 ]}

Algunas etiquetas funcionan mediante electroquimioluminiscencia (ECL), en la que la etiqueta emite luz detectable en respuesta a una corriente eléctrica. ^{[ 16 ] [ 17 ]}

Si bien en los inmunoensayos se suele emplear algún tipo de marcador, existen ciertos tipos de ensayos que no dependen de marcadores, sino que utilizan métodos de detección que no requieren la modificación ni el marcaje de los componentes del ensayo. La resonancia de plasmones superficiales es un ejemplo de técnica que permite detectar la unión entre un anticuerpo no marcado y antígenos. ^{[ 18 ]} Otro inmunoensayo sin marcadores demostrado consiste en medir el cambio de resistencia en un electrodo a medida que los antígenos se unen a él. ^{[ 19 ]}

En un inmunoensayo competitivo y homogéneo, el analito no marcado de una muestra compite con el analito marcado para unirse a un anticuerpo. Posteriormente, se mide la cantidad de analito marcado no unido. En teoría, cuanto mayor sea la cantidad de analito en la muestra, mayor será la cantidad de analito marcado desplazado y, por lo tanto, medido; de ahí que la cantidad de analito marcado no unido sea proporcional a la cantidad de analito en la muestra.

• El inmunoensayo de polarización de fluorescencia (FPIA) mide la señal de polarización de fluorescencia después de la incubación, sin separar los marcadores unidos de los libres. Se añaden moléculas análogas del analito marcadas libres a la muestra, y su movimiento browniano difiere cuando están unidas a un anticuerpo (Ab) grande en comparación con cuando están libres en solución. El analito compite por unirse al Ab, y si el analito marcado se une al Ab, se produce una señal. La intensidad de la señal es inversamente proporcional a la concentración del analito. ^{[ 21 ]}
• En la técnica de inmunoensayo enzimático multiplicado (EMIT) , moléculas análogas del analito libre, marcadas con una enzima (por ejemplo, la enzima glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), compiten con el analito que se está analizando. La enzima activa reduce el NAD (sin señal) a NADH (que absorbe a 340  nm), por lo que la absorbancia se monitoriza a 340  nm. Cuando el analito marcado se une al anticuerpo, la enzima se inactiva y se genera una señal por el marcador libre. La intensidad de la señal es directamente proporcional a la concentración del analito. ^{[ 21 ]}
• El inmunoensayo de canalización de oxígeno luminiscente (LOCI) genera especies de oxígeno singlete en microesferas acopladas al analito, y cuando el analito se une a la molécula de Ab correspondiente, acoplada a otro tipo de microesfera, el analito reacciona con el oxígeno singlete, generando señales de quimioluminiscencia proporcionales a la concentración del complejo analito-Ab. ^{[ 21 ]}
• En la interacción cinética de micropartículas en solución (KIMS) y el inmunoensayo de inhibición turbidimétrica potenciado por partículas (PETINIA) , los anticuerpos libres se unen a los conjugados de micropartículas del fármaco para formar agregados que absorben en el rango visible en ausencia del analito. En presencia del analito, el anticuerpo se une al analito libre, impidiendo la agregación de las micropartículas y provocando una reducción de la absorbancia. La señal es inversamente proporcional a la concentración del analito. ^{[ 21 ]}
• El inmunoensayo con donador de enzima clonada (CEDIA) consiste en la ingeniería genética de una enzima (p. ej., beta-galactosidasa) para dividirla en dos fragmentos inactivos: un pequeño donador de enzima (ED) conjugado con el análogo del fármaco y un aceptor de enzima (EA) de mayor tamaño. Cuando ambos fragmentos se asocian, la enzima completa convierte un sustrato en un producto coloreado resultante de la escisión. Si hay moléculas del fármaco analito presentes, estas compiten con el fármaco marcado con ED en solución por los sitios de unión limitados del anticuerpo. El análogo del fármaco marcado con ED libre se unirá al EA, generando una señal colorimétrica directamente proporcional a la cantidad de analito. ^{[ 21 ]}

Al igual que en un inmunoensayo competitivo y homogéneo, el analito no marcado en una muestra compite con el analito marcado para unirse a un anticuerpo. En los ensayos heterogéneos, el analito marcado no unido se separa o se elimina mediante lavado, y se mide el analito marcado restante que se ha unido.

Al mezclar una muestra con anticuerpos marcados, el analito objetivo se une a dichos anticuerpos. Los anticuerpos marcados que no se unen se eliminan mediante lavado, y se miden los anticuerpos marcados que sí se unen. La intensidad de la señal es directamente proporcional a la cantidad de analito presente en la muestra.

El analito de la muestra desconocida se une al sitio del anticuerpo, y luego el anticuerpo marcado se une al analito. A continuación, se mide la cantidad de anticuerpo marcado en dicho sitio. Esta cantidad será directamente proporcional a la concentración del analito, ya que el anticuerpo marcado no se unirá si el analito no está presente en la muestra desconocida. Este tipo de inmunoensayo también se conoce como ensayo sándwich, puesto que el analito se encuentra entre dos anticuerpos.

Una amplia gama de pruebas médicas son inmunoensayos, denominados inmunodiagnósticos en este contexto. Muchas pruebas de embarazo caseras son inmunoensayos que detectan el marcador del embarazo gonadotropina coriónica humana (hCG ). ^{[ 22 ]} Más específicamente, son pruebas cualitativas que detectan la presencia de hCG mediante un sistema de flujo lateral . ^{[ 23 ]} La prueba rápida de antígenos para la COVID-19 también es una prueba cualitativa de flujo lateral. ^{[ 24 ]}

Otros inmunoensayos clínicos son cuantitativos; miden cantidades. Los inmunoensayos pueden medir los niveles de CK-MB para evaluar enfermedades cardíacas, insulina para evaluar hipoglucemia , antígeno prostático específico para detectar cáncer de próstata , y algunos también se utilizan para la detección y/o medición cuantitativa de ciertos compuestos farmacéuticos (véase la técnica de inmunoensayo enzimático multiplicado para más detalles). ^{[ 25 ]}

Las pruebas de detección de drogas también comienzan con un inmunoensayo cualitativo rápido. ^{[ 26 ]}

Los inmunoensayos se utilizan en laboratorios antidopaje deportivos para analizar muestras de sangre de atletas en busca de hormona de crecimiento humana recombinante prohibida (rhGH, rGH, hGH, GH). ^{[ 27 ]}

El inmunoensayo fotoacústico mide señales acústicas de baja frecuencia generadas por marcadores de nanopartículas metálicas . Iluminadas por una luz modulada a una longitud de onda de resonancia plasmónica, las nanopartículas generan una fuerte señal acústica que puede medirse con un micrófono. ^{[ 28 ]} El inmunoensayo fotoacústico puede aplicarse a pruebas de flujo lateral que utilizan nanopartículas coloidales. ^{[ 29 ]}