Inmunofluorescencia

La inmunofluorescencia (IF) es una técnica basada en microscopía óptica que permite la detección y localización de una amplia variedad de biomoléculas diana dentro de una célula o tejido a nivel cuantitativo. La técnica utiliza la especificidad de unión de anticuerpos y antígenos . ^{[ 1 ]} La región específica que un anticuerpo reconoce en un antígeno se denomina epítopo . Varios anticuerpos pueden reconocer el mismo epítopo, pero difieren en su afinidad de unión. El anticuerpo con mayor afinidad por un epítopo específico superará a los anticuerpos con menor afinidad por el mismo epítopo. ^{[ 2 ] [ 3 ]}

Al conjugar el anticuerpo con un fluoróforo , se visualiza la posición de la biomolécula diana excitando el fluoróforo y midiendo la emisión de luz en una longitud de onda específica predefinida mediante un microscopio de fluorescencia . Es fundamental que la unión del fluoróforo al anticuerpo no interfiera con la especificidad inmunológica del anticuerpo ni con la capacidad de unión a su antígeno. ^{[ 4 ] [ 5 ]}

La inmunofluorescencia es un ejemplo ampliamente utilizado de inmunotinción (que emplea anticuerpos para teñir proteínas) y un ejemplo específico de inmunohistoquímica (que estudia la relación anticuerpo-antígeno en los tejidos). Esta técnica utiliza principalmente fluoróforos para visualizar la localización de los anticuerpos, mientras que otras provocan un cambio de color en el entorno que contiene el antígeno de interés o emplean un marcador radiactivo. Las técnicas de inmunofluorescencia que utilizan anticuerpos marcados fueron conceptualizadas en la década de 1940 por Albert H. Coons . ^{[ 2 ] [ 6 ] [ 7 ]}

La inmunofluorescencia se utiliza para analizar la distribución de proteínas , glicanos , pequeñas moléculas biológicas y no biológicas, y para visualizar estructuras como filamentos de tamaño intermedio. ^{[ 8 ]}

Si la topología de una membrana celular es indeterminada, la inserción de epítopos en proteínas puede utilizarse junto con la inmunofluorescencia para determinar estructuras dentro de la membrana celular. ^{[ 9 ]} La inmunofluorescencia (IF) también puede utilizarse como un método "semicuantitativo" para obtener información sobre los niveles y patrones de localización de la metilación del ADN. La IF también puede utilizarse en combinación con otros métodos de tinción fluorescente sin anticuerpos, por ejemplo, el uso de DAPI para marcar el ADN . ^{[ 10 ] [ 11 ]}

El examen de muestras de inmunofluorescencia se puede realizar utilizando diversas configuraciones de microscopio, incluyendo el microscopio de epifluorescencia , el microscopio confocal y el microscopio de campo amplio. ^{[ 12 ]}

La inmunofluorescencia se limita a células fijas (es decir, muertas) al estudiar estructuras dentro de la célula, ya que los anticuerpos generalmente no penetran las membranas celulares o subcelulares intactas en células vivas, debido a que son proteínas grandes. Para visualizar estas estructuras, el material antigénico debe fijarse firmemente en su localización natural dentro de la célula. ^{[ 17 ]} Para estudiar estructuras dentro de células vivas, en combinación con la fluorescencia, se pueden utilizar proteínas recombinantes que contienen dominios de proteínas fluorescentes, por ejemplo, la proteína verde fluorescente (GFP). La técnica de GFP implica alterar la información genética de las células. ^{[ 18 ] [ 19 ]}

Un problema importante de la inmunofluorescencia es el fotoblanqueo , ^{[ 12 ]} la pérdida permanente de la capacidad del fluoróforo para emitir luz. ^{[ 1 ]} Para mitigar el riesgo de fotoblanqueo, se pueden emplear diferentes estrategias. Al reducir o limitar la intensidad o el tiempo de exposición a la luz, se disminuye el ciclo de absorción-emisión de la luz fluorescente, preservando así la funcionalidad del fluoróforo. También se puede aumentar la concentración de fluoróforos u optar por fluoróforos más robustos que presenten resistencia al fotoblanqueo, como Alexa Fluors , Seta Fluors o DyLight Fluors . ^{[ 2 ]}

Otros problemas que pueden surgir al usar técnicas de inmunofluorescencia incluyen autofluorescencia , superposición espectral y tinción no específica. ^{[ 1 ] [ 2 ]} La autofluorescencia incluye la fluorescencia natural emitida por el propio tejido o célula de la muestra. La superposición espectral ocurre cuando un fluoróforo tiene un espectro de emisión amplio que se superpone con el espectro de otro fluoróforo, dando lugar a señales falsas. La tinción no específica ocurre cuando el anticuerpo, que contiene el fluoróforo, se une a proteínas no deseadas debido a una similitud suficiente en el epítopo. Esto puede conducir a falsos positivos. ^{[ 2 ] [ 4 ] [ 1 ]} Al estudiar la especificidad de la tinción de IgG como método para evaluar fugas de la barrera hematoencefálica en ratones, un estudio de 2025 encontró una reducción completa en la tinción no específica al calentar secciones cerebrales a 75  °C y reducciones significativas con una combinación de pretratamiento con peróxido de hidrógeno e inhibidor de la catalasa 3-AT. ^{[ 20 ]}

Las principales mejoras en la inmunofluorescencia radican en el desarrollo de fluoróforos y microscopios de fluorescencia. Los fluoróforos pueden modificarse estructuralmente para mejorar el brillo y la fotoestabilidad, conservando al mismo tiempo las propiedades espectrales y la permeabilidad celular. ^{[ 21 ]}

Los métodos de microscopía de fluorescencia de superresolución pueden producir imágenes con una resolución mayor que la de los microscopios limitados por el límite de difracción . Esto permite determinar detalles estructurales dentro de la célula. ^{[ 22 ]} La superresolución en fluorescencia, más específicamente, se refiere a la capacidad de un microscopio para evitar la fluorescencia simultánea de fluoróforos adyacentes espectralmente idénticos (superposición espectral). Algunos de los métodos de microscopía de fluorescencia de superresolución desarrollados recientemente incluyen la microscopía de agotamiento por emisión estimulada ( STED ), la microscopía de iluminación estructurada saturada (SSIM), la microscopía de localización por fotoactivación de fluorescencia (F PALM ) y la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM). ^{[ 23 ]}

• Albert Hewett Coons (1912–1978), médico , patólogo e inmunólogo.
• Cornelia Mitchell Downs (1892–1987), microbióloga y periodista.

• anticuerpos
• Afecciones cutáneas con hallazgos de inmunofluorescencia
• Fluorescencia
• Inmunoquímica
• Inmunohistoquímica
• Parches y tapas

• Imágenes relacionadas con enfermedades autoinmunes. Archivadas el 25 de septiembre de 2009 en la Wayback Machine de la Universidad de Birmingham.
• Información general sobre Davidson College
• Inmunofluorescencia en los Encabezamientos de Materias Médicas (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU.