Microscopía de reflexión de interferencia

La microscopía de reflexión por interferencia ( IRM ), también llamada microscopía de contraste por interferencia por reflexión ( RICM ) o microscopía de contraste por reflexión ( RCM ), según los elementos ópticos específicos utilizados, es una técnica de microscopía óptica que aprovecha los efectos de interferencia de película delgada para formar una imagen de un objeto sobre una superficie de vidrio. La intensidad de la señal es una medida de la proximidad del objeto a la superficie de vidrio. Esta técnica se puede utilizar para estudiar eventos en la membrana celular sin el uso de un marcador (fluorescente), como en el caso de la microscopía TIRF .

En 1964, Adam SG Curtis acuñó el término Microscopía de Reflexión de Interferencia ( IRM ), utilizándolo en el campo de la biología celular para estudiar fibroblastos de corazón de pollo embrionario. ^{[ 1 ] [ 2 ]} Utilizó IRM para observar los sitios de adhesión y las distancias de los fibroblastos, notando que el contacto con el vidrio se limitaba principalmente a la periferia celular y los pseudópodos . ^{[ 1 ]}

En 1975, Johan Sebastiaan Ploem introdujo una mejora a la IRM (publicada en un capítulo de libro ^{[ 3 ]} ), que denominó Microscopía de Contraste por Reflexión ( RCM ). ^{[ 4 ]} La mejora consiste en utilizar un objetivo antiflexión y polarizadores cruzados para reducir aún más la luz parásita en el sistema óptico. Hoy en día, este esquema se conoce principalmente como Microscopía de Contraste por Interferencia por Reflexión ( RICM ), ^{[ 5 ] [ 6 ]} nombre que fue introducido por Bareiter-Hahn y Konrad Beck en 1979. ^{[ 7 ]}

Sin embargo, el término IRM se utiliza a veces para describir una configuración RICM. La multiplicidad de nombres utilizados para describir la técnica ha causado cierta confusión, y fue discutida ya en 1985 por Verschueren. ^{[ 8 ]}

Para formar una imagen de la célula adherida, se hace pasar luz de una longitud de onda específica a través de un polarizador . Esta luz polarizada linealmente se refleja mediante un divisor de haz hacia el objetivo , que enfoca la luz sobre la muestra. La superficie del vidrio es reflectante hasta cierto punto y reflejará la luz polarizada. La luz que no se refleja en el vidrio penetrará en la célula y se reflejará en la membrana celular. Pueden darse tres situaciones. Primero, cuando la membrana está cerca del vidrio, la luz reflejada por el vidrio se desplaza media longitud de onda, de modo que la luz reflejada por la membrana tendrá un desfase con respecto a las fases de la luz reflejada por el vidrio y, por lo tanto, se anulan mutuamente ( interferencia ). Esta interferencia produce un píxel oscuro en la imagen final (el caso de la izquierda en la figura). Segundo, cuando la membrana no está adherida al vidrio, la reflexión de la membrana tiene un desfase menor con respecto a la luz reflejada por el vidrio y, por lo tanto, no se anulan mutuamente, lo que produce un píxel brillante en la imagen (el caso de la derecha en la figura). En tercer lugar, cuando no hay muestra, solo se detecta la luz reflejada por el vidrio, que aparecerá como píxeles brillantes en la imagen final.

La luz reflejada regresa al divisor de haz y pasa a través de un segundo polarizador, que elimina la luz dispersa, antes de llegar al detector (generalmente una cámara CCD ) para formar la imagen final. Los polarizadores pueden aumentar la eficiencia al reducir la luz dispersa; sin embargo, en una configuración moderna con una cámara digital sensible, no son necesarios. ^{[ 9 ]}

Para obtener imágenes de células mediante IRM, un microscopio necesita al menos los siguientes elementos: 1) una fuente de luz, como una lámpara halógena , 2) un filtro óptico (que deja pasar un pequeño rango de longitudes de onda) y 3) un divisor de haz (que refleja el 50 % y transmite el 50 % de la longitud de onda elegida).

La fuente de luz debe producir luz de alta intensidad, ya que se perderá mucha luz en el divisor de haz y en la propia muestra. Diferentes longitudes de onda dan como resultado diferentes imágenes IRM; Bereiter-Hahn y sus colegas demostraron que, para sus células PtK 2, la luz con una longitud de onda de 546  nm produjo un mejor contraste que la luz azul con una longitud de onda de 436  nm. ^{[ 7 ]} Se han realizado muchos refinamientos a la teoría básica de IRM, la mayoría de los cuales aumentan la eficiencia y el rendimiento de la formación de imágenes. Al colocar polarizadores y una lámina de cuarto de onda entre el divisor de haz y la muestra, la luz polarizada linealmente se puede convertir en luz polarizada circularmente y luego volver a convertirla en luz polarizada linealmente, lo que aumenta la eficiencia del sistema. El artículo sobre polarizadores circulares analiza este proceso en detalle. Además, al incluir un segundo polarizador, que está girado 90° con respecto al primero, se puede evitar que la luz parásita llegue al detector, aumentando la relación señal/ruido (véase la Figura 2 de Verschueren ^{[ 8 ]} ).

Existen varias formas en que la IRM puede utilizarse para estudiar muestras biológicas. Los primeros ejemplos de uso de la técnica se centraron en la adhesión celular ^{[ 1 ]} y la migración celular . ^{[ 11 ]}

Fusión de vesículas

Más recientemente, la técnica se ha utilizado para estudiar la exocitosis en células cromafines . ^{[ 9 ]} Al observarse mediante DIC, las células cromafines aparecen como células redondas con pequeñas protuberancias. Al observarse la misma célula mediante IRM, la huella de la célula en el vidrio se puede ver claramente como un área oscura con pequeñas protuberancias. Cuando las vesículas se fusionan con la membrana, aparecen como pequeños círculos claros dentro de la huella oscura (puntos brillantes en la célula superior del panel derecho).

En el vídeo 1 se muestra un ejemplo de fusión de vesículas en células cromafines mediante IRM. Tras la estimulación con 60 mM de potasio , aparecen múltiples puntos brillantes dentro de la zona oscura de la célula cromafín como resultado de la exocitosis de gránulos de núcleo denso . Dado que IRM no requiere un marcador fluorescente, puede combinarse con otras técnicas de imagen, como la epifluorescencia y la microscopía TIRF, para estudiar la dinámica de las proteínas junto con la exocitosis y la endocitosis de vesículas. Otra ventaja de la ausencia de marcadores fluorescentes es la menor fototoxicidad . 

• Limozin, Laurent; Sengupta, Kheya (09-11-2009). "Microscopía cuantitativa de contraste de interferencia por reflexión (RICM) en materia blanda y adhesión celular". ChemPhysChem . 10 (16): 2752– 2768. doi : 10.1002/cphc.200900601 . ISSN 1439-4235 . 

• Facultad de Medicina Albert Einstein sobre IRM
• Microscopía confocal reflejada en Nikon MicroscopyU