Ensayo de protección con gentamicina

El ensayo de protección con gentamicina , también conocido como ensayo de supervivencia o ensayo de invasión , es un método utilizado en microbiología . Se utiliza para cuantificar la capacidad de las bacterias patógenas para invadir células eucariotas .

El ensayo se basa en varias observaciones realizadas en la década de 1970, en las que se informó sobre la capacidad de las bacterias internalizadas para evitar ser eliminadas por los antibióticos . ^{[ 1 ] [ 2 ]} El ensayo comenzó a utilizarse en la investigación biológica a principios de la década de 1980.

Las bacterias intracelulares necesitan entrar en las células del huésped ( células del organismo infectado ) para replicarse y propagar la infección. Muchas especies de Shigella (que causa la disentería bacilar ), Salmonella ( fiebre tifoidea ), Mycobacterium ( lepra y tuberculosis ) y Listeria ( listeriosis ), por nombrar solo algunas, son intracelulares.

Varios antibióticos no pueden penetrar las células eucariotas. Por lo tanto, no pueden dañar las bacterias intracelulares que ya se encuentran dentro de ellas. El uso de estos antibióticos nos permite diferenciar entre las bacterias que logran penetrar las células eucariotas y las que no. La aplicación de dicho antibiótico a un cultivo de células eucariotas infectadas con bacterias eliminaría las bacterias que permanecen fuera de las células, preservando las que sí penetraron. El antibiótico de elección para este ensayo es el aminoglucósido gentamicina .

Las células HeLa se utilizan habitualmente como células eucariotas en el ensayo de protección con gentamicina, pero también se pueden utilizar otras células. En cuanto a las bacterias, solo se pueden analizar las especies sensibles a la gentamicina.

El ensayo se realiza en placas de microtitulación de plástico , comúnmente utilizadas en laboratorios para el cultivo de células eucariotas. Las células se dejan crecer en los pocillos durante la noche, formando una capa uniforme. Las bacterias se cultivan por separado durante la noche. Al día siguiente, las células eucariotas se inoculan con las bacterias y se incuban juntas durante una hora. Centrifugar las placas durante unos minutos puede facilitar el contacto entre células y bacterias e iniciar la infección.

Tras la infección, se añade gentamicina a las placas y se incuban durante una hora, permitiendo que el antibiótico elimine todas las bacterias que no pudieron penetrar en las células y permanecieron fuera. A continuación, se lavan bien las placas para eliminar las bacterias muertas. Posteriormente, las células eucariotas se lisan con un detergente , generalmente Triton X-100 .

Las bacterias que penetraron las células y sobrevivieron se liberan y se siembran en placas de agar sólido . Al día siguiente, contando las colonias que se forman en las placas y conociendo la cantidad de bacterias utilizadas al inicio del ensayo, el investigador puede calcular el porcentaje de bacterias que lograron invadir las células eucariotas.

El ensayo de protección con gentamicina se utiliza comúnmente en la investigación de patógenos. Mediante este método, se puede evaluar fácilmente la contribución de genes o proteínas específicos a la capacidad de las bacterias para invadir células. El gen en cuestión puede ser inactivado y la capacidad invasiva de la bacteria se compara con la de bacterias normales de tipo silvestre . También se pueden evaluar las condiciones ambientales, como el pH y la temperatura , para determinar su efecto sobre la capacidad invasiva.

El ensayo de protección con gentamicina es muy sensible, ya que puede detectar la internalización incluso de bacterias individuales. Sin embargo, presenta varios inconvenientes:

• En ocasiones, la gentamicina puede penetrar en las células eucariotas y eliminar las bacterias internalizadas. Esto puede ocurrir si la permeabilidad de las células aumenta durante el ensayo, a veces debido a una manipulación inadecuada de las mismas.
• En ocasiones, las bacterias internalizadas pueden no estar completamente protegidas del entorno externo, por ejemplo, cuando el fagosoma (la vacuola que rodea a la bacteria dentro de la célula) presenta algún defecto. La gentamicina puede eliminar estas bacterias.
• Es posible que la gentamicina no logre eliminar todas las bacterias que quedaron fuera de las células.

Para evaluar la precisión de un ensayo, se deben realizar controles positivos y negativos . Al realizar el ensayo como se describe anteriormente, se deben incluir bacterias que se sabe que son completamente invasivas (control positivo) y bacterias que se sabe que no son invasivas (control negativo).

Una alternativa para evaluar la invasión bacteriana es la inmunotinción diferencial , basada en la unión de anticuerpos a las bacterias antes y después de la invasión. Los anticuerpos emiten luz fluorescente de color , y los resultados de esta prueba se observan al microscopio .

• Parásito intracelular obligado