reacción en cadena de la polimerasa inversa

La reacción en cadena de la polimerasa inversa ( PCR inversa ) es una variante de la PCR convencional que se utiliza para amplificar ADN con una única secuencia conocida. Una limitación de la PCR convencional es que requiere cebadores complementarios a ambos extremos del ADN diana, pero este método permite realizar la PCR incluso si solo se dispone de una secuencia a partir de la cual se pueden diseñar los cebadores.

La PCR inversa es especialmente útil para determinar la ubicación de las inserciones . Por ejemplo, diversos retrovirus y transposones se integran aleatoriamente en el ADN genómico . ^{[ 1 ]} Para identificar los sitios de inserción, se pueden utilizar las secuencias virales o de transposones conocidas, denominadas "internas", para diseñar cebadores que amplifiquen una pequeña porción del ADN genómico adyacente, denominado "externo". El producto amplificado se puede secuenciar y comparar con bases de datos de ADN para localizar la secuencia que ha sido interrumpida.

El método de PCR inversa implica una serie de digestiones con enzimas de restricción y ligación , lo que da como resultado un fragmento en bucle que puede ser cebado para PCR a partir de una única sección de secuencia conocida. Luego, al igual que en otros procesos de reacción en cadena de la polimerasa, el ADN se amplifica mediante la ADN polimerasa termoestable :

1. Se identifica una región objetivo con una sección interna de secuencia conocida y regiones flanqueantes desconocidas.
2. El ADN genómico se digiere en fragmentos de unos pocos kilobases mediante una enzima de restricción que corta con una frecuencia generalmente baja-moderada (6-8 bases) .
3. En condiciones de baja concentración de ADN o de ligación rápida, se induce la autoligación, lo que da como resultado un producto de ADN circular.
4. La PCR se lleva a cabo como de costumbre con la plantilla circular, utilizando cebadores complementarios a secciones de la secuencia interna conocida que apuntan hacia el exterior.

Finalmente, la secuencia del producto de PCR secuenciado se compara con bases de datos de secuencias. Esto se utiliza en el caso del rastreo cromosómico.