Cromatografía líquida de alto rendimiento

La cromatografía líquida de alto rendimiento ( HPLC ), anteriormente denominada cromatografía líquida de alta presión , es una técnica cromatográfica en química analítica que se utiliza para separar, identificar y cuantificar componentes específicos ( analitos ) en mezclas. Estas mezclas pueden provenir de alimentos , productos químicos , productos farmacéuticos , ^{[ 1 ]} muestras biológicas , ambientales y agrícolas , etc., en las que la muestra analizada es líquida o se ha disuelto en un líquido. ^{[ 2 ]}

La HPLC es esencialmente una forma presurizada de cromatografía en columna , que utiliza bombas presurizadas en lugar de la fuerza de la gravedad, y columnas más delgadas y largas con partículas adsorbentes más pequeñas. Esto aumenta su resolución analítica.

La HPLC se utiliza ampliamente para fines de fabricación ( p. ej. , durante el proceso de producción de productos farmacéuticos y biológicos), ^{[ 3 ]}^{[ 4 ]} legales ( p. ej. , detección de sustancias dopantes en la orina), ^{[ 5 ]} de investigación ( p. ej. , separación de los componentes de una muestra biológica compleja o de sustancias químicas sintéticas similares entre sí) y médicos ( p. ej. , detección de los niveles de vitamina D en el suero sanguíneo). ^{[ 6 ]}

Las bombas de alta presión fuerzan mezclas de varios solventes (la fase móvil , p. ej ., agua, tampones , acetonitrilo y/o metanol ) a fluir a través de una mezcla de muestra y recoger los analitos, entregándolos en un cilindro (la columna cromatográfica ). La columna está llena de partículas sólidas hechas de material adsorbente (la fase estacionaria ). Las partículas suelen estar hechas de sílice , polímeros y tienen un diámetro de 1,5 a 50 μm. ^{[ 7 ]}^{[ 8 ]}^{[ 9 ]} La elución ocurre cuando la fase móvil pasa a través de la fase estacionaria. Cada componente de la muestra interactúa de manera diferente con el material adsorbente y los solventes, por lo que sus velocidades de elución son diferentes. ^{[ 2 ]} Estas diferentes velocidades conducen a la separación analítica de las especies en el fluido que sale de la columna (el eluido). El eluido entra en un detector cromatográfico específico, como los detectores UV , que produce un gráfico (el cromatograma ). Un cromatograma es una gráfica de la intensidad de la señal del detector en función del tiempo o del volumen de la fase móvil. Si los analitos están bien separados, el cromatograma mostrará picos bien definidos, uno por cada analito. Cada analito aparece en su tiempo correspondiente (tiempo de retención) con un área proporcional a su cantidad. ^{[ 7 ]}

La cromatografía puede describirse como un proceso de transferencia de masa que implica adsorción y/o partición . Como se mencionó, la HPLC se basa en bombas para hacer pasar un líquido presurizado y una mezcla de muestra a través de una columna llena con el adsorbente (el componente activo de la columna). Algunos analitos pueden unirse fuertemente al adsorbente en lugar del eluyente, mientras que otros pueden hacer lo contrario. Es decir, los analitos pueden tener diferentes coeficientes de partición , lo que lleva a su separación. La interacción entre el analito, la fase sólida y la fase líquida es física o químicamente reversible, generalmente una combinación de interacciones no covalentes . ^{[ 10 ]}^{[ 11 ]}

Operación

El cromatógrafo líquido es complejo ^{[ 12 ]} y cuenta con una tecnología sofisticada y delicada. Para operar correctamente el sistema, es necesario tener un conocimiento básico de cómo el dispositivo procesa los datos para evitar datos incorrectos y resultados distorsionados. ^{[ 13 ]}^{[ 14 ]}^{[ 15 ]}

La HPLC se distingue de la cromatografía líquida tradicional ("de baja presión") porque las presiones de operación son significativamente más altas (alrededor de 50–1400 bar), mientras que la cromatografía líquida convencional generalmente se basa en la fuerza de la gravedad para hacer pasar la fase móvil a través de la columna empaquetada. Debido a la pequeña cantidad de muestra que se separa en la HPLC analítica, las dimensiones típicas de la columna son de 2,1–4,6 mm de diámetro y de 30–250 mm de longitud. Además, las columnas de HPLC se fabrican con partículas adsorbentes más pequeñas (1,5–50 μm de tamaño medio de partícula). Esto le confiere a la HPLC un poder de resolución superior (la capacidad de distinguir entre compuestos) al separar mezclas en un período de tiempo más corto, lo que la convierte en una técnica cromatográfica popular. ^{[ 16 ]}

El esquema de un instrumento HPLC generalmente incluye depósitos de solventes, una o más bombas, un desgasificador de solventes , un muestreador, una columna y un detector. Los solventes se preparan con anticipación según las necesidades de la separación, pasan por el desgasificador para eliminar los gases disueltos, se mezclan para formar la fase móvil y luego fluyen a través del muestreador, que introduce la mezcla de muestra en la corriente de la fase móvil, la cual la transporta a la columna. Las bombas suministran el flujo y la composición deseados de la fase móvil a través de la fase estacionaria dentro de la columna, y luego directamente a una celda de flujo dentro del detector. El detector genera una señal proporcional a la cantidad de componente de la muestra que emerge de la columna, lo que permite el análisis cuantitativo de los componentes de la muestra. El detector también registra el tiempo de emergencia, el tiempo de retención, que sirve para la identificación inicial del componente. Los detectores más avanzados también proporcionan información adicional, específica de las características del analito, como el espectro UV-Vis o el espectro de masas , que pueden brindar información sobre sus características estructurales. Estos detectores son de uso común, como los detectores UV/Vis, de matriz de fotodiodos (PDA) / detectores de matriz de diodos y detectores de espectrometría de masas . ^{[ 17 ]}^{[ 18 ]}

Un microprocesador digital y un software de usuario controlan el instrumento HPLC y proporcionan análisis de datos. Algunos modelos de bombas mecánicas en un instrumento HPLC pueden mezclar varios solventes en proporciones que varían con el tiempo, generando un gradiente de composición en la fase móvil. Los instrumentos HPLC más modernos cuentan con un horno de columna que permite ajustar la temperatura a la que se realiza la separación. ^{[ 19 ]}

La mezcla de muestra que se va a separar y analizar se introduce, en un volumen pequeño y discreto (normalmente microlitros), en la corriente de fase móvil que percola a través de la columna. Los componentes de la muestra se mueven a través de la columna, cada uno a una velocidad diferente, que depende de interacciones físicas específicas con el adsorbente, la fase estacionaria. La velocidad de cada componente depende de su naturaleza química, de la naturaleza de la fase estacionaria (dentro de la columna) y de la composición de la fase móvil. El tiempo en el que un analito específico eluye (sale de la columna) se denomina tiempo de retención. El tiempo de retención, medido en condiciones particulares, es una característica identificativa de un analito determinado.

Existen diversos tipos de columnas, rellenas con adsorbentes que varían en tamaño de partícula, porosidad y química superficial. El uso de materiales de relleno con partículas más pequeñas requiere una mayor presión de operación ("contrapresión") y, por lo general, mejora la resolución cromatográfica (el grado de separación de picos entre analitos consecutivos que emergen de la columna). Las partículas adsorbentes pueden ser iónicas, hidrofóbicas o polares.

El modo más común de cromatografía líquida es la fase inversa , en la que las fases móviles utilizadas incluyen cualquier combinación miscible de agua o tampones con diversos disolventes orgánicos (los más comunes son acetonitrilo y metanol). Algunas técnicas de HPLC utilizan fases móviles sin agua (véase cromatografía de fase normal más adelante). El componente acuoso de la fase móvil puede contener ácidos (como ácido fórmico, fosfórico o trifluoroacético ) o sales para facilitar la separación de los componentes de la muestra. La composición de la fase móvil puede mantenerse constante ("modo de elución isocrática") o variar ("modo de elución por gradiente") durante el análisis cromatográfico. La elución isocrática suele ser eficaz para la separación de mezclas simples. La elución por gradiente es necesaria para mezclas complejas, con interacciones variables con las fases estacionaria y móvil. Por este motivo, en la elución por gradiente la composición de la fase móvil varía normalmente de baja a alta fuerza de elución. La fuerza de elución de la fase móvil se refleja en los tiempos de retención del analito, ya que una alta fuerza de elución acelera la elución (lo que resulta en una disminución de los tiempos de retención). Por ejemplo, un perfil de gradiente típico en cromatografía de fase inversa podría comenzar con un 5 % de acetonitrilo (en agua o tampón acuoso) y progresar linealmente hasta un 95 % de acetonitrilo en 5 a 25 minutos. Los períodos de composición constante de la fase móvil (meseta) también pueden formar parte de un perfil de gradiente. Por ejemplo, la composición de la fase móvil puede mantenerse constante al 5 % de acetonitrilo durante 1 a 3 minutos, seguida de un cambio lineal hasta un 95 % de acetonitrilo.

La composición elegida de la fase móvil depende de la intensidad de las interacciones entre los distintos componentes de la muestra («analitos») y la fase estacionaria ( por ejemplo , las interacciones hidrofóbicas en la cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa). Según su afinidad por las fases estacionaria y móvil, los analitos se distribuyen entre ambas durante el proceso de separación que tiene lugar en la columna. Este proceso de distribución es similar al que se produce durante una extracción líquido-líquido , pero es continuo, no por etapas.

En el ejemplo que utiliza un gradiente de agua/acetonitrilo, los componentes más hidrofóbicos eluirán ( saldrán de la columna) más tarde; luego, una vez que la fase móvil se enriquece en acetonitrilo ( es decir , en una fase móvil que se convierte en una solución de mayor elución), su elución se acelera.

La elección de los componentes de la fase móvil, los aditivos (como sales o ácidos) y las condiciones del gradiente depende de la naturaleza de la columna y de los componentes de la muestra. A menudo se realizan varias pruebas con la muestra para encontrar el método de HPLC que proporcione una separación adecuada.

Historia y desarrollo

Antes de la HPLC, los científicos utilizaban técnicas de cromatografía líquida en columna de sobremesa. Los sistemas de cromatografía líquida eran en gran medida ineficientes debido a que el caudal de los disolventes dependía de la gravedad. Las separaciones tardaban muchas horas, y a veces días, en completarse. La cromatografía de gases (GC) era entonces más potente que la cromatografía líquida (LC); sin embargo, era evidente que la separación en fase gaseosa y el análisis de biopolímeros de alto peso molecular muy polares eran imposibles. ^{[ 20 ]} La GC era ineficaz para muchas aplicaciones de ciencias de la vida y salud para biomoléculas, porque en su mayoría no son volátiles y son térmicamente inestables a las altas temperaturas de la GC. ^{[ 21 ]} Como resultado, se plantearon métodos alternativos que pronto darían lugar al desarrollo de la HPLC.

Tras el trabajo fundamental de Martin y Synge en 1941, Calvin Giddings , ^{[ 22 ]} Josef Huber y otros predijeron en la década de 1960 que la LC podría operarse en modo de alta eficiencia reduciendo el diámetro de la partícula de empaquetamiento sustancialmente por debajo del nivel típico de LC (y GC) de 150 μm y utilizando presión para aumentar la velocidad de la fase móvil. ^{[ 20 ]} Estas predicciones fueron objeto de una extensa experimentación y perfeccionamiento a lo largo de los años 60 y 70, hasta nuestros días. ^{[ 23 ]} Las primeras investigaciones de desarrollo comenzaron a mejorar las partículas de LC, por ejemplo, el histórico Zipax, una partícula superficialmente porosa. ^{[ 24 ]}

La década de 1970 trajo consigo muchos avances en hardware e instrumentación. Los investigadores comenzaron a utilizar bombas e inyectores para crear un diseño rudimentario de un sistema HPLC. ^{[ 25 ]} Las bombas amplificadoras de gas eran ideales porque operaban a presión constante y no requerían sellos herméticos ni válvulas de retención para un flujo constante y una buena cuantificación. ^{[ 21 ]} Se lograron hitos en hardware en Dupont IPD (División de Polímeros Industriales), como la utilización de un dispositivo de gradiente de bajo volumen de permanencia, así como la sustitución del inyector de septo por una válvula de inyección de bucle. ^{[ 21 ]}

Aunque los avances en instrumentación fueron importantes, la historia de la HPLC se centra principalmente en la historia y evolución de la tecnología de partículas . ^{[ 21 ]}^{[ 26 ]} Tras la introducción de partículas de capa porosa, se ha observado una tendencia constante a reducir el tamaño de las partículas para mejorar la eficiencia. ^{[ 21 ]} Sin embargo, al disminuir el tamaño de las partículas, surgieron nuevos problemas. Las desventajas prácticas se derivan de la excesiva caída de presión necesaria para forzar el fluido móvil a través de la columna y de la dificultad de preparar un empaquetamiento uniforme de materiales extremadamente finos. ^{[ 27 ]} Cada vez que se reduce significativamente el tamaño de las partículas, suele ser necesario un nuevo desarrollo de instrumentación para soportar la presión. ^{[ 23 ]}^{[ 21 ]}

Tipos

Cromatografía de partición

La cromatografía de partición fue uno de los primeros tipos de cromatografía que desarrollaron los químicos y apenas se utiliza hoy en día. ^{[ 28 ]} El principio del coeficiente de partición se ha aplicado en cromatografía en papel , cromatografía de capa fina , fase gaseosa y aplicaciones de separación líquido-líquido . El Premio Nobel de Química de 1952 fue otorgado a Archer John Porter Martin y Richard Laurence Millington Synge por el desarrollo de esta técnica, que se utilizó para la separación de aminoácidos . ^{[ 29 ]} La cromatografía de partición utiliza un disolvente retenido, en la superficie o dentro de los granos o fibras de una matriz de soporte sólida "inerte", como en la cromatografía en papel; o aprovecha alguna interacción coulómbica y/o donadora de hidrógeno con la fase estacionaria. Las moléculas del analito se reparten entre una fase estacionaria líquida y el eluyente. Al igual que en la cromatografía de interacción hidrofílica (HILIC; una subtécnica dentro de la HPLC), este método separa los analitos en función de las diferencias en su polaridad. La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) de partición se ha utilizado tradicionalmente en soportes de sílice o alúmina no unidos. Ambos métodos funcionan eficazmente para separar analitos según sus diferencias de polaridad relativas. Las fases estacionarias unidas de HILIC tienen la ventaja de separar solutos ácidos , básicos y neutros en una sola corrida cromatográfica. ^{[ 30 ]}

Los analitos polares se difunden en una capa de agua estacionaria asociada a la fase estacionaria polar, donde quedan retenidos. Cuanto más fuertes sean las interacciones entre el analito polar y la fase estacionaria polar (en relación con la fase móvil), mayor será el tiempo de elución. La intensidad de la interacción depende de los grupos funcionales de la estructura molecular del analito: los grupos más polarizados ( por ejemplo , hidroxilo) y los capaces de formar enlaces de hidrógeno inducen una mayor retención. Las interacciones coulombianas (electrostáticas) también pueden aumentar la retención. El uso de disolventes más polares en la fase móvil disminuye el tiempo de retención de los analitos, mientras que los disolventes más hidrofóbicos tienden a aumentarlo.

Cromatografía de fase normal

La cromatografía de fase normal fue uno de los primeros tipos de HPLC que desarrollaron los químicos, pero su uso ha disminuido en las últimas décadas. También conocida como HPLC de fase normal (NP-HPLC), este método separa los analitos en función de su afinidad por una superficie estacionaria polar como la sílice; por lo tanto, se basa en la capacidad del analito para participar en interacciones polares (como enlaces de hidrógeno o interacciones de tipo dipolo-dipolo ) con la superficie del adsorbente. La NP-HPLC utiliza una fase móvil no polar y no acuosa ( por ejemplo , cloroformo ) y funciona eficazmente para separar analitos fácilmente solubles en disolventes no polares. El analito se asocia con la fase estacionaria polar y es retenido por ella. Las fuerzas de adsorción aumentan con el aumento de la polaridad del analito. La fuerza de interacción depende no solo de los grupos funcionales presentes en la estructura de la molécula del analito, sino también de factores estéricos . El efecto del impedimento estérico sobre la fuerza de interacción permite que este método resuelva (separe) isómeros estructurales .

El uso de disolventes más polares en la fase móvil disminuirá el tiempo de retención de los analitos, mientras que los disolventes más hidrofóbicos tienden a inducir una elución más lenta (aumento de los tiempos de retención). Los disolventes muy polares, como trazas de agua en la fase móvil, tienden a adsorberse a la superficie sólida de la fase estacionaria, formando una capa estacionaria ligada (de agua) que se considera que desempeña un papel activo en la retención. Este comportamiento es algo peculiar de la cromatografía de fase normal, ya que está gobernado casi exclusivamente por un mecanismo de adsorción ( es decir , los analitos interactúan con una superficie sólida en lugar de con la capa solvatada de un ligando unido a la superficie del adsorbente; véase también la HPLC de fase inversa más adelante). La cromatografía de adsorción todavía se utiliza en cierta medida para la separación de isómeros estructurales tanto en formato de columna como de cromatografía de capa fina sobre soportes de sílice o alúmina activada (desecada).

La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con partición y sin partición cayó en desuso en la década de 1970 con el desarrollo de la HPLC de fase inversa, debido a la escasa reproducibilidad de los tiempos de retención causada por la presencia de una capa de agua o disolvente orgánico prótico en la superficie de los soportes cromatográficos de sílice o alúmina . Esta capa varía con cualquier cambio en la composición de la fase móvil ( por ejemplo , el nivel de humedad), lo que provoca fluctuaciones en los tiempos de retención.

Recientemente, la cromatografía de partición ha vuelto a popularizarse gracias al desarrollo de fases estacionarias ligadas Hilic , que demuestran una reproducibilidad mejorada, y debido a una mejor comprensión del rango de utilidad de la técnica.

cromatografía de desplazamiento

El uso de la cromatografía de desplazamiento es bastante limitado y se utiliza principalmente para la cromatografía preparativa. El principio básico se basa en una molécula con alta afinidad por la matriz cromatográfica (el desplazador) que se utiliza para competir eficazmente por los sitios de unión y, por lo tanto, desplazar todas las moléculas con menor afinidad. ^{[ 31 ]} Existen diferencias claras entre la cromatografía de desplazamiento y la de elución. En el modo de elución, las sustancias suelen emerger de una columna en picos gaussianos estrechos. Se desea una amplia separación de los picos, preferiblemente hasta la línea base, para lograr la máxima purificación. La velocidad a la que cualquier componente de una mezcla se desplaza por la columna en el modo de elución depende de muchos factores. Pero para que dos sustancias se desplacen a velocidades diferentes y, por lo tanto, se resuelvan, debe haber diferencias sustanciales en alguna interacción entre las biomoléculas y la matriz cromatográfica. Los parámetros de operación se ajustan para maximizar el efecto de esta diferencia. En muchos casos, la separación de la línea base de los picos solo se puede lograr con elución en gradiente y cargas bajas en la columna. Por lo tanto, dos inconvenientes de la cromatografía en modo de elución, especialmente a escala preparativa, son la complejidad operativa, debido al bombeo de solvente en gradiente, y el bajo rendimiento, debido a la baja carga de la columna. La cromatografía de desplazamiento presenta ventajas sobre la cromatografía de elución, ya que los componentes se separan en zonas consecutivas de sustancias puras en lugar de "picos". Dado que el proceso aprovecha la no linealidad de las isotermas, se puede separar una mayor cantidad de muestra en una columna determinada, recuperando los componentes purificados a una concentración significativamente mayor.

Cromatografía líquida de fase inversa (RP-LC)

Cromatograma de una mezcla compleja (agua perfumada) obtenido mediante HPLC de fase inversa.

La cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (RP-HPLC) ^{[ 32 ]} es la modalidad cromatográfica más extendida. Cuenta con una fase estacionaria no polar y una fase móvil acuosa moderadamente polar. Su uso es tan común entre biólogos y profesionales de las ciencias de la vida que a menudo se la denomina simplemente "HPLC". La industria farmacéutica también la emplea habitualmente para cualificar fármacos antes de su comercialización.

En los métodos de fase inversa, las sustancias se retienen en el sistema cuanto más hidrofóbicas son. Para la retención de materiales orgánicos, las fases estacionarias consisten principalmente en gránulos porosos de gel de sílice empaquetados en la columna. Suelen tener forma esférica con diámetros variables (menos de 2, 3, 5, 7 y 10 μm ) y diámetros de poro variables (60, 100, 150 y 300 Å ). En su superficie se encuentran ligandos alquilo de cadena lineal unidos químicamente, como C3, C4, C8 y C18. El número indica la cantidad de átomos de carbono en un ligando. Por ejemplo, un ligando C3 es un propilo . Cuanto más largo sea el ligando de hidrocarburo en la fase estacionaria, mayor será la retención de los componentes de la muestra. La mayoría de los métodos actuales de separación de materiales biomédicos utilizan la fase estacionaria C18, a veces denominada con nombres comerciales como ODS (octadecilsilano) o RP-18 (Fase Invertida 18). Para fabricar dichas fases estacionarias, se trata la superficie de partículas de gel de sílice con RMe₂SiCl _, donde R _{es un grupo alquilo}_de cadena lineal como _{C₁₈H₃₇} o _C₈H₁₇ .

Para separar compuestos aromáticos , o en general compuestos con muchos enlaces pi , la fase estacionaria puede tener ligandos superficiales de fenilo .

A pH < 2, el enlace entre el ligando y el gel de sílice puede disolverse. A pH > 8, la sílice misma puede disolverse. Cuando se requieren soluciones con pH extremos, la fase estacionaria puede estar compuesta de sílice polimerizada con sustancias orgánicas o de polímeros orgánicos hidrofóbicos.

Con estas fases estacionarias, el tiempo de retención es mayor para las moléculas no polares, mientras que las moléculas polares eluyen con mayor facilidad (aparecen antes en el análisis). Un cromatógrafo puede aumentar los tiempos de retención añadiendo más agua a la fase móvil. Dado que el agua es altamente polar, hace que el analito no polar interactúe con mayor intensidad con la fase estacionaria no polar. De manera similar, un investigador puede disminuir el tiempo de retención añadiendo más disolvente orgánico no polar a la fase móvil.

La cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (RP-HPLC) se basa en el principio de las interacciones hidrofóbicas, que se originan en la alta simetría de la estructura dipolar del agua y desempeñan un papel fundamental en todos los procesos de las ciencias de la vida. La RP-HPLC permite medir estas fuerzas interactivas. La unión del analito a la fase estacionaria es proporcional al área de contacto alrededor del segmento no polar de la molécula del analito al unirse al ligando en la fase estacionaria. Este efecto solvofóbico está dominado por la fuerza del agua para ^la "reducción de cavidades" alrededor del analito y la cadena C18, _{en comparación con el complejo formado por ambos. La energía liberada en}^este proceso es proporcional a la tensión superficial del eluyente (agua: 7,3 × 10⁻⁶ J /cm² ^, metanol: 2,2 × 10⁻⁶ J/cm² ⁾ y a la superficie hidrofóbica del analito y del ligando, respectivamente. La retención puede disminuirse añadiendo un disolvente menos polar (metanol, acetonitrilo ) a la fase móvil para reducir la tensión superficial del agua. La elución por gradiente aprovecha este efecto reduciendo automáticamente la polaridad y la tensión superficial de la fase móvil acuosa durante el análisis.

Las propiedades estructurales de la molécula del analito pueden influir significativamente en sus características de retención. En teoría, un analito con una mayor superficie hidrofóbica (enlaces atómicos C–H, C–C y, en general, no polares, como SS y otros) puede retenerse durante más tiempo, ya que no interactúa con la estructura del agua. Por otro lado, los analitos con una mayor superficie polar (debido a la presencia de grupos polares, como -OH, -NH₂ _, COO⁻ ^o -NH₃⁺ _{en su estructura) se retienen}^menos , puesto que se integran mejor en el agua. Las interacciones con la fase estacionaria también pueden verse afectadas por efectos estéricos o de exclusión, por los cuales un componente de una molécula muy grande puede tener un acceso restringido a los poros de la fase estacionaria, donde tienen lugar las interacciones con los ligandos de la superficie (cadenas alquílicas). Este impedimento estérico suele resultar en una menor retención.

El tiempo de retención aumenta con una mayor superficie hidrofóbica (no polar) de las moléculas. Por ejemplo, los compuestos de cadena ramificada pueden eluir más rápidamente que sus isómeros lineales correspondientes, debido a que su superficie total es menor. De manera similar, los compuestos orgánicos con enlaces simples C–C suelen eluir más tarde que aquellos con enlaces C=C o C≡C, ya que el doble o triple enlace hace que la molécula sea más compacta que un enlace simple.

Otro factor importante es el pH de la fase móvil, ya que puede modificar el carácter hidrofóbico del analito ionizable. Por esta razón, la mayoría de los métodos utilizan un agente tampón , como el fosfato de sodio , para controlar el pH. Los efectos del control del pH y de los tampones varían según la aplicación, pero generalmente mejoran la resolución cromatográfica para los analitos ionizables. Los tampones cumplen múltiples funciones:

Control del pH, que afecta al estado de ionización de los analitos ionizables.
Afectan la carga sobre las partes ionizables de la superficie de la fase estacionaria. Por ejemplo, la superficie de sílice entre los ligandos de la fase enlazada suele estar cubierta con grupos silanol que pueden desprotonarse .
Actúan como agentes de apareamiento iónico para neutralizar la carga del analito.

Si se utiliza espectrometría de masas para analizar el eluido, a menudo se añade un ácido orgánico volátil al eluyente, como ácido acético o ácido fórmico . El formiato de amonio se añade comúnmente para mejorar la detección de ciertos analitos mediante la formación de aductos de amonio-analito , que son más volátiles que los propios analitos.

El ácido trifluoroacético (TFA), como aditivo a la fase móvil, se utiliza ampliamente para el análisis de mezclas complejas de muestras biomédicas, principalmente péptidos y proteínas, empleando detectores basados en UV. El TFA también aumenta la retención de analitos como los ácidos carboxílicos en aplicaciones que utilizan otros detectores (como UV-VIS), dado que es un ácido orgánico bastante fuerte. Sin embargo, rara vez se utiliza en métodos de espectrometría de masas debido a los residuos que puede dejar en el detector y el sistema de suministro de disolvente, los cuales interfieren con el análisis y la detección.

Las partículas de sílice en fase inversa son menos propensas a dañarse en comparación con las partículas de sílice en fase normal, ya que están protegidas por ligandos hidrofóbicos unidos a la superficie. Sin embargo, la mayoría de las columnas de fase inversa están compuestas por partículas de sílice derivatizadas con alquilo y son propensas a la hidrólisis de la sílice en condiciones ácidas (pH < 2). Además, la sílice se disuelve en condiciones alcalinas (pH > 8). Existen marcas selectas de partículas híbridas o reforzadas a base de sílice para columnas de fase inversa que pueden utilizarse en condiciones de pH extremas. Las condiciones altamente ácidas también pueden corroer las partes metálicas del equipo de HPLC.

Por regla general, en la mayoría de los casos, las columnas de RP-HPLC deben lavarse con disolvente limpio después de su uso para eliminar ácidos o tampones residuales y almacenarse en una composición de disolvente adecuada. Algunas aplicaciones biomédicas requieren un entorno no metálico para una separación óptima. Para estos casos sensibles, existe una prueba para determinar el contenido de metal de una columna que consiste en inyectar una muestra que es una mezcla de 2,2'- y 4,4'- bipiridina . Debido a que la 2,2'-bipiridina puede quelar el metal, la forma del pico de la 2,2'-bipiridina se distorsionará (con cola) cuando haya iones metálicos presentes en la superficie de la sílice .

Cromatografía de exclusión por tamaño

La cromatografía de exclusión por tamaño ( SEC ) ^{[ 33 ]} separa moléculas de polímeros y biomoléculas en función de las diferencias en su tamaño molecular (en realidad, por el radio de Stokes de la partícula ). El proceso de separación se basa en la capacidad de las moléculas de la muestra para permear a través de los poros de las esferas de gel, empaquetadas dentro de la columna, y depende del tamaño relativo de las moléculas del analito y del tamaño de poro del adsorbente. El proceso también se basa en la ausencia de interacciones con la superficie del material de empaquetamiento.

Existen dos tipos principales de SEC:

Cromatografía de permeación en gel (GPC) : separación de polímeros sintéticos (solubles en agua u orgánicos), utilizando principalmente disolventes orgánicos.
Cromatografía de filtración en gel (GFC) : separación de biopolímeros solubles en agua (típicamente proteínas), utilizando principalmente disolventes acuosos.

El principio de separación en SEC se basa en la penetración total o parcial de las sustancias de alto peso molecular de la muestra en las partículas porosas de la fase estacionaria durante su transporte a través de la columna. El eluyente de la fase móvil se selecciona de forma que impida por completo las interacciones con la superficie de la fase estacionaria. En estas condiciones, cuanto menor sea el tamaño de la molécula, mayor será su capacidad de penetración en el espacio poroso y mayor será el tiempo de tránsito a través de la columna. Por otro lado, cuanto mayor sea el tamaño molecular, mayor será la probabilidad de que la molécula no penetre completamente en los poros de la fase estacionaria, e incluso que los rodee, por lo que se eluirá antes. Las moléculas se separan en orden decreciente de peso molecular, eluyendo primero las moléculas más grandes y posteriormente las más pequeñas. Las moléculas de mayor tamaño que el poro no entran en él y se eluyen juntas como el primer pico del cromatograma; este volumen se denomina volumen de exclusión total y define el límite de exclusión para una columna determinada. Las moléculas pequeñas penetrarán completamente a través de los poros de las partículas de la fase estacionaria y se eluirán al final, marcando el final del cromatograma, y pueden aparecer como un marcador de penetración total.

En ciencias biomédicas, generalmente se considera una cromatografía de baja resolución y, por lo tanto, suele reservarse para la etapa final de purificación. También es útil para determinar la estructura terciaria y cuaternaria de proteínas purificadas. La SEC se utiliza principalmente para el análisis de moléculas grandes, como proteínas o polímeros. La SEC también funciona de forma preparativa al atrapar las moléculas más pequeñas en los poros de las partículas. Las moléculas más grandes simplemente pasan por los poros, ya que son demasiado grandes para entrar en ellos. Por consiguiente, las moléculas más grandes fluyen a través de la columna más rápidamente que las más pequeñas; es decir, cuanto más pequeña es la molécula, mayor es su tiempo de retención.

Esta técnica se utiliza ampliamente para la determinación del peso molecular de polisacáridos. La SEC es la técnica oficial de la Farmacopea Europea para la comparación del peso molecular de diferentes heparinas de bajo peso molecular disponibles comercialmente . ^{[ 34 ]}

Cromatografía de intercambio iónico

La cromatografía de intercambio iónico ( IEC ) o cromatografía iónica ( IC ) ^{[ 35 ]} es una técnica analítica para la separación y determinación de solutos iónicos en muestras acuosas de origen ambiental e industrial, como la industria metalúrgica, aguas residuales industriales, sistemas biológicos, muestras farmacéuticas, alimentos, etc.

En la cromatografía de intercambio iónico (IEC), existen sitios con carga eléctrica unidos a la fase estacionaria. Los iones del soluto con la misma carga que los iones de la columna son repelidos y eluyen sin retención, mientras que los iones del soluto con carga opuesta a los sitios cargados de la columna se retienen en ella. En general, los iones con mayor carga y menor radio se retienen con mayor fuerza. Los iones del soluto retenidos en la columna pueden eluirse modificando la composición de la fase móvil, por ejemplo, aumentando su concentración de sal y pH, o incrementando la temperatura de la fase estacionaria, entre otras modificaciones.

Entre los tipos de intercambiadores iónicos se incluyen las resinas de poliestireno , los intercambiadores iónicos de celulosa y dextrano (geles) y el vidrio de poro controlado o el gel de sílice poroso . Las resinas de poliestireno permiten la reticulación, lo que aumenta la estabilidad de la cadena. Una mayor reticulación reduce la desviación, lo que incrementa el tiempo de equilibrio y, en última instancia, mejora la selectividad. Los intercambiadores iónicos de celulosa y dextrano poseen poros de mayor tamaño y bajas densidades de carga, lo que los hace adecuados para la separación de proteínas.

Un aumento en la concentración de contraiones (en relación con los grupos funcionales de las resinas) reduce el tiempo de retención, ya que genera una fuerte competencia con los iones del soluto. Una disminución del pH reduce el tiempo de retención en el intercambio catiónico, mientras que un aumento del pH lo reduce en el intercambio aniónico. Por ejemplo, al disminuir el pH del disolvente en una columna de intercambio catiónico, hay más iones hidrógeno disponibles para competir por posiciones en la fase estacionaria aniónica, eluyendo así los cationes débilmente unidos.

Esta forma de cromatografía se utiliza ampliamente en las siguientes aplicaciones: purificación de agua, preconcentración de componentes traza, cromatografía de intercambio de ligandos, cromatografía de intercambio iónico de proteínas, cromatografía de intercambio aniónico a pH alto de carbohidratos y oligosacáridos, entre otras.

Cromatografía de afinidad

La cromatografía de afinidad de alto rendimiento (HPAC) ^{[ 36 ]} funciona haciendo pasar una solución de muestra a través de una columna empaquetada con una fase estacionaria que contiene un ligando biológicamente activo inmovilizado. El ligando es, de hecho, un sustrato que tiene una afinidad de unión específica por la molécula diana en la solución de muestra. La molécula diana se une al ligando, mientras que las demás moléculas de la solución de muestra atraviesan la columna con poca o ninguna retención. Posteriormente, la molécula diana se eluye de la columna utilizando un tampón de elución adecuado.

Este proceso cromatográfico se basa en la capacidad de las sustancias activas unidas para formar complejos estables, específicos y reversibles gracias a su reconocimiento biológico de ciertos componentes específicos de la muestra. La formación de estos complejos implica la participación de fuerzas moleculares comunes como la interacción de Van der Waals , la interacción electrostática, la interacción dipolo-dipolo, la interacción hidrofóbica y el enlace de hidrógeno. Se forma un enlace eficiente y específico mediante la acción simultánea y concertada de varias de estas fuerzas en los sitios de unión complementarios.

Cromatografía acuosa de fase normal

La cromatografía acuosa de fase normal ( ANP ) también se denomina cromatografía líquida de interacción hidrofílica ( HILIC ). ^{[ 37 ]} Esta es una técnica cromatográfica que abarca la región de la fase móvil entre la cromatografía de fase inversa (RP) y la cromatografía orgánica de fase normal (ONP). La HILIC se utiliza para lograr una selectividad única para compuestos hidrofílicos, ^{[ 38 ]} mostrando un orden de elución de fase normal, utilizando "disolventes de fase inversa", es decir, disolventes relativamente polares, en su mayoría no acuosos, en la fase móvil. ^{[ 37 ]} Muchas moléculas biológicas, especialmente las que se encuentran en fluidos biológicos, son compuestos polares pequeños que no se retienen bien en la HPLC de fase inversa. Esto ha convertido a la cromatografía líquida de interacción hidrofílica (HILIC) en una alternativa atractiva y un enfoque útil para el análisis de moléculas polares. Además, debido a que la HILIC se utiliza de forma rutinaria con mezclas acuosas tradicionales con disolventes orgánicos polares como ACN y metanol, se puede acoplar fácilmente a la espectrometría de masas (MS). ^{[ 38 ]}

Elución isocrática y con gradiente

Durante la separación, la composición de la fase móvil puede permanecer constante o cambiar. Si permanece constante, el proceso se denomina isocrático (que significa composición constante ). El término fue acuñado por Csaba Horvath , uno de los pioneros de la HPLC. ^{[ 39 ]}^{[ 40 ]}

Si cambia, entonces el proceso se denomina elución por gradiente . ^{[ 41 ]}^{[ 42 ]} Por ejemplo, un gradiente puede comenzar en 10% de metanol en agua y terminar en 90% de metanol en agua después de 20 minutos. Los dos componentes de la fase móvil se denominan típicamente "A" y "B"; A es el disolvente "débil" que permite que el soluto eluya lentamente, mientras que B es el disolvente "fuerte" que eluye rápidamente los solutos de la columna. En la cromatografía de fase inversa , el disolvente A suele ser agua o un tampón acuoso, mientras que B es un disolvente orgánico miscible con agua, como acetonitrilo , metanol, THF o isopropanol .

En la elución isocrática, el ancho del pico aumenta linealmente con el tiempo de retención según la ecuación para N, el número de platos teóricos. Esto puede ser una desventaja importante al analizar una muestra que contiene analitos con un amplio rango de factores de retención. El uso de una fase móvil más débil prolonga el tiempo de ejecución y provoca que los picos de elución lenta se ensanchen, lo que reduce la sensibilidad. Una fase móvil más fuerte mejoraría los problemas de tiempo de ejecución y ensanchamiento de los picos posteriores, pero resultaría en una menor separación de picos, especialmente para los analitos de elución rápida, que pueden no tener tiempo suficiente para resolverse por completo. Este problema se aborda modificando la composición de la fase móvil en la elución por gradiente.

Al partir de una fase móvil más débil y fortalecerla durante el análisis, la elución por gradiente disminuye la retención de los componentes que eluyen más tarde, lo que permite que eluyan más rápido, generando picos más estrechos (y altos) para la mayoría de los componentes, a la vez que facilita la separación adecuada de los componentes que eluyen antes. Esto también mejora la forma de los picos con cola, ya que la concentración creciente del eluyente orgánico desplaza la parte final del pico hacia adelante. Esto también aumenta la altura del pico (el pico se ve más nítido), lo cual es importante en el análisis de trazas. El programa de gradiente puede incluir incrementos bruscos en el porcentaje del componente orgánico o diferentes pendientes en distintos momentos, todo ello según el objetivo de lograr una separación óptima en el menor tiempo posible.

En la elución isocrática, el orden de retención no cambia si cambian las dimensiones de la columna (longitud y diámetro interno); es decir, los picos eluyen en el mismo orden. Sin embargo, en la elución por gradiente, el orden de elución puede cambiar a medida que cambian las dimensiones o el caudal, si no se escalan hacia abajo o hacia arriba según el cambio ^{[ 43 ].}

La fuerza motriz en la cromatografía de fase inversa se origina en el alto orden de la estructura del agua. La función del componente orgánico de la fase móvil es reducir este alto orden y, por lo tanto, disminuir la capacidad de retardo del componente acuoso.

Parámetros

Teorético

La teoría de la cromatografía general se aplica a la HPLC. ^{[ 44 ]} Esta teoría es la base de las pruebas de idoneidad del sistema de la Farmacopea de los Estados Unidos , ^{[ 45 ]} que son un conjunto de criterios cuantitativos para determinar qué tan adecuado es un sistema de HPLC para el análisis requerido en cualquier etapa del mismo.

Esta relación también se representa como un factor normalizado adimensional conocido como factor de retención o parámetro de retención, que es la medida experimental de la relación de capacidad, como se muestra también en la Figura de Criterios de Rendimiento. t _R es el tiempo de retención del componente específico y t ₀ es el tiempo que tarda una sustancia no retenida en eluir a través del sistema sin retención alguna, por lo que se denomina Tiempo Vacío.

La relación entre los factores de retención, k', de cada dos picos adyacentes en el cromatograma se utiliza en la evaluación del grado de separación entre ellos, y se denomina factor de selectividad , α, como se muestra en el gráfico de Criterios de Rendimiento.

El recuento de platos N como criterio de eficiencia del sistema se desarrolló para condiciones isocráticas, es decir, una composición constante de la fase móvil durante toda la corrida. En condiciones de gradiente, donde la fase móvil cambia con el tiempo durante la corrida cromatográfica, es más apropiado usar el parámetro capacidad de picos P _c como medida de la eficiencia del sistema. ^{[ 46 ]} La definición de capacidad de picos en cromatografía es el número de picos que se pueden separar dentro de una ventana de retención para un factor de resolución específico predefinido, generalmente ~1. También podría verse como el tiempo de corrida medido en número de anchos promedio de picos. La ecuación se muestra en la Figura de los criterios de rendimiento. En esta ecuación tg es el tiempo de gradiente y w(ave) es el ancho promedio de los picos en la base.

Los parámetros se derivan principalmente de dos conjuntos de teoría cromatográfica: la teoría de placas (como parte de la cromatografía de partición ) y la teoría cinética de la cromatografía/ ecuación de van Deemter . Por supuesto, pueden ponerse en práctica mediante el análisis de cromatogramas de HPLC, aunque la teoría cinética se considera la más precisa.

Son análogos al cálculo del factor de retención en una separación por cromatografía en papel , pero describen la eficacia con la que la HPLC separa una mezcla en dos o más componentes que se detectan como picos (bandas) en un cromatograma. Los parámetros de la HPLC son: el factor de eficiencia ( N ), el factor de retención (kappa prima) y el factor de separación (alfa). En conjunto, estos factores son variables en una ecuación de resolución, que describe la separación o superposición de los picos de dos componentes. Estos parámetros se utilizan principalmente para describir separaciones en HPLC de fase inversa y de fase normal, ya que estas separaciones tienden a ser más sutiles que otros modos de HPLC ( por ejemplo , intercambio iónico y exclusión por tamaño).

El volumen muerto es el espacio que ocupa el disolvente en una columna. Se trata del espacio dentro de la columna que queda fuera del material de relleno interno. El volumen muerto se mide en un cromatograma como el primer pico detectado, que suele corresponder al disolvente presente en la muestra. Idealmente, el disolvente de la muestra fluye a través de la columna sin interactuar con ella, pero aun así es detectable y distinto del disolvente de HPLC. El volumen muerto se utiliza como factor de corrección.

El factor de eficiencia ( N ) mide prácticamente la nitidez de los picos de los componentes en el cromatograma, como la relación entre el área del pico del componente ("tiempo de retención") y el ancho de los picos en su punto más ancho (en la línea base). Los picos altos, nítidos y relativamente estrechos indican que el método de separación eliminó eficazmente un componente de la mezcla; es decir, una alta eficiencia. La eficiencia depende en gran medida de la columna de HPLC y del método de HPLC utilizado. El factor de eficiencia es sinónimo de número de platos teóricos.

El factor de retención ( kappa prima ) mide cuánto tiempo permanece un componente de la mezcla adherido a la columna, y se determina mediante el área bajo la curva de su pico en un cromatograma (ya que los cromatogramas de HPLC dependen del tiempo). Cada pico del cromatograma tendrá su propio factor de retención ( por ejemplo , kappa 1 para el factor de retención del primer pico). Este factor puede corregirse mediante el volumen muerto de la columna.

El factor de separación ( alfa ) es una medida relativa de la eficacia con la que se separan dos componentes adyacentes de la mezcla ( es decir , dos bandas adyacentes en un cromatograma). Este factor se define como la relación entre los factores de retención de un par de picos adyacentes en el cromatograma y puede corregirse mediante el volumen muerto de la columna. Cuanto mayor sea el valor del factor de separación (superior a 1,0), mejor será la separación, hasta aproximadamente 2,0, a partir del cual probablemente no sea necesario un método de HPLC para la separación. Las ecuaciones de resolución relacionan estos tres factores, de modo que una alta eficiencia y un alto factor de separación mejoran la resolución de los picos de los componentes en una separación por HPLC.

Diámetro interno

El diámetro interno (DI) de una columna de HPLC es un parámetro importante. ^{[ 47 ]} Puede influir en la respuesta de detección cuando se reduce debido a la menor difusión lateral de la banda de soluto. También puede afectar la selectividad de separación, cuando el caudal y los volúmenes de inyección no se escalan proporcionalmente al diámetro menor o mayor utilizado, tanto en modo isocrático como en modo gradiente. ^{[ 48 ]} Determina la cantidad de analito que se puede cargar en la columna. Las columnas de mayor diámetro se suelen ver en aplicaciones preparativas, como la purificación de un producto farmacéutico para su uso posterior. ^{[ 49 ]} Las columnas de DI bajo han mejorado la sensibilidad y el consumo de solvente en la reciente cromatografía líquida de ultra alto rendimiento (UHPLC). ^{[ 50 ]}

Las columnas con un diámetro interno mayor (superior a 10 mm) se utilizan para purificar cantidades útiles de material debido a su gran capacidad de carga.

Las columnas de escala analítica (4,6 mm) han sido el tipo de columna más común, aunque las columnas más estrechas están ganando popularidad rápidamente. ^{[ 50 ]} Se utilizan en el análisis cuantitativo tradicional de muestras y a menudo emplean un detector de absorbancia UV-Vis .

Las columnas de diámetro reducido (1–2 mm) se utilizan en aplicaciones donde se desea una mayor sensibilidad, ya sea con detectores UV-Vis especiales, detección por fluorescencia o con otros métodos de detección como la cromatografía líquida-espectrometría de masas.

Las columnas capilares (de menos de 0,3 mm) se utilizan casi exclusivamente con métodos de detección alternativos, como la espectrometría de masas . Suelen estar fabricadas con capilares de sílice fundida , en lugar de los tubos de acero inoxidable que emplean las columnas de mayor tamaño.

Tamaño de partícula

La mayoría de las cromatografías líquidas de alta resolución (HPLC) tradicionales se realizan con la fase estacionaria adherida a la superficie de pequeñas partículas esféricas de sílice (microesferas). Estas partículas vienen en diversos tamaños, siendo las microesferas de 5 μm las más comunes. Generalmente, las partículas más pequeñas proporcionan mayor superficie y mejores separaciones, pero la presión requerida para una velocidad lineal óptima aumenta con el inverso del cuadrado del diámetro de la partícula. ^{[ 51 ]}^{[ 52 ]}^{[ 53 ]}

Según las ecuaciones ^{[ 54 ]} de la velocidad de la columna, la eficiencia y la contrapresión , reducir el diámetro de la partícula a la mitad y mantener el tamaño de la columna igual, duplicará la velocidad y la eficiencia de la columna; pero aumentará la contrapresión cuatro veces. Y las partículas pequeñas de HPLC también pueden disminuir el ensanchamiento del ancho. ^{[ 55 ]} Las partículas más grandes se utilizan en HPLC preparativa (diámetros de columna de 5 cm hasta >30 cm) y para aplicaciones no HPLC como la extracción en fase sólida .

Tamaño de los poros

Muchas fases estacionarias son porosas para proporcionar una mayor superficie. Los poros pequeños ofrecen una mayor superficie, mientras que los poros de mayor tamaño favorecen una mejor cinética, especialmente para analitos de mayor tamaño. Por ejemplo, una proteína ligeramente más pequeña que un poro podría entrar en él, pero no saldría fácilmente una vez dentro.

Presión de la bomba

Las bombas varían en capacidad de presión, pero su rendimiento se mide por su capacidad para producir un caudal volumétrico constante y reproducible . La presión puede alcanzar hasta 60 MPa (6000 lbf/in² ⁾ , o aproximadamente 600 atmósferas. Los sistemas HPLC modernos se han mejorado para trabajar a presiones mucho más altas y, por lo tanto, pueden utilizar tamaños de partícula mucho más pequeños en las columnas (<2 μm). Estos sistemas de "cromatografía líquida de ultra alto rendimiento" o UHPLC, que también podrían conocerse como sistemas de cromatografía de ultra alta presión, ^[⁵⁶^] pueden trabajar hasta 120 MPa (17 405 lbf/in² ⁾ , o aproximadamente 1200 atmósferas. ^[⁵⁷^] El término "UPLC" ^[⁵⁸^] es una marca registrada de Waters Corporation , pero a veces se utiliza para referirse a la técnica más general de UHPLC.

Detectores

Los detectores de HPLC se dividen en dos categorías principales: universales o selectivos. Los detectores universales suelen medir una propiedad global ( p. ej. , índice de refracción ) midiendo la diferencia de una propiedad física entre la fase móvil y la fase móvil con el soluto, mientras que los detectores selectivos miden una propiedad del soluto ( p. ej ., absorbancia UV-Vis ) simplemente respondiendo a la propiedad física o química del soluto. ^{[ 59 ]} La HPLC utiliza con mayor frecuencia un detector de absorbancia UV-Vis ; sin embargo, se puede utilizar una amplia gama de otros detectores cromatográficos . Un detector universal que complementa la detección de absorbancia UV-Vis es el detector de aerosol cargado (CAD). Un tipo de detector comúnmente utilizado son los detectores de índice de refracción, que proporcionan lecturas midiendo los cambios en el índice de refracción del eluyente a medida que se mueve a través de la celda de flujo. En ciertos casos, es posible utilizar varios detectores; por ejemplo, la LC-MS normalmente combina UV-Vis con un espectrómetro de masas.

Cuando se utiliza con un detector electroquímico (ECD), el HPLC-ECD detecta selectivamente neurotransmisores como la norepinefrina , la dopamina , la serotonina , el glutamato , el GABA, la acetilcolina y otros en aplicaciones de investigación de análisis neuroquímico. ^{[ 60 ]} El HPLC-ECD detecta neurotransmisores en el rango femtomolar . Otros métodos para detectar neurotransmisores incluyen la cromatografía líquida-espectrometría de masas, ELISA o radioinmunoensayos.

Muestreadores automáticos

Mediante el uso de automuestreadores de HPLC, se puede inyectar automáticamente un gran número de muestras en un sistema de HPLC. Además, los automuestreadores de HPLC mantienen un volumen y una técnica de inyección idénticos para cada inyección, lo que proporciona una alta precisión en el volumen de inyección. Es posible agitar la muestra dentro de la cámara de muestreo, lo que favorece la homogeneidad. ^{[ 61 ]}

Aplicaciones

Fabricación

La HPLC tiene muchas aplicaciones tanto en el laboratorio como en la ciencia clínica. Es una técnica común utilizada en el desarrollo farmacéutico, ya que es una forma confiable de obtener y asegurar la pureza del producto. ^{[ 62 ]} Si bien la HPLC puede producir productos de altísima calidad (puros), no siempre es el método principal utilizado en la producción de materias primas farmacéuticas. ^{[ 63 ]} Según la farmacopea europea, la HPLC se utiliza en solo el 15,5 % de las síntesis. ^{[ 64 ]} Sin embargo, desempeña un papel en el 44 % de las síntesis en la farmacopea de los Estados Unidos. ^{[ 65 ]} Esto posiblemente se deba a diferencias en las limitaciones monetarias y de tiempo, ya que la HPLC a gran escala puede ser una técnica costosa. Un aumento en la especificidad, precisión y exactitud que se produce con la HPLC corresponde, desafortunadamente, a un aumento en el costo.

Legal

Esta técnica también se utiliza para la detección de drogas ilícitas en varias muestras. ^{[ 66 ]} El método más común de detección de drogas ha sido un inmunoensayo . ^{[ 67 ]} Este método es mucho más conveniente. Sin embargo, la conveniencia se obtiene a costa de la especificidad y la cobertura de una amplia gama de drogas, por lo que la HPLC también se ha utilizado como método alternativo. Dado que la HPLC es un método para determinar (y posiblemente aumentar) la pureza, usar la HPLC sola para evaluar las concentraciones de drogas era algo insuficiente. Por lo tanto, en este contexto, la HPLC a menudo se realiza junto con la espectrometría de masas . ^{[ 68 ]} El uso de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) en lugar de cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) evita la necesidad de derivatizar con agentes acetilantes o alquilantes, lo que puede ser un paso adicional engorroso. ^{[ 69 ]} La LC-MS se ha utilizado para detectar una variedad de agentes como agentes dopantes, metabolitos de fármacos, conjugados de glucurónido, anfetaminas, opioides, cocaína, BZD, ketamina, LSD, cannabis y pesticidas. ^{[ 70 ]}^{[ 71 ]} Realizar HPLC junto con espectrometría de masas reduce la necesidad absoluta de estandarizar las corridas experimentales de HPLC.

Investigación

Se pueden realizar ensayos similares con fines de investigación, detectando concentraciones de posibles candidatos clínicos como fármacos antifúngicos y para el asma. ^{[ 72 ]} Esta técnica también resulta útil para observar múltiples especies en muestras recolectadas, pero requiere el uso de soluciones estándar cuando se busca información sobre la identidad de las especies. Se utiliza como método para confirmar los resultados de reacciones de síntesis, ya que la pureza es esencial en este tipo de investigación. Sin embargo, la espectrometría de masas sigue siendo la forma más fiable de identificar especies.

Ciencias médicas y de la salud

El uso médico de HPLC normalmente utiliza un espectrómetro de masas (MS) como detector, por lo que la técnica se llama LC-MS ^{[ 73 ]} o LC-MS/MS para MS en tándem, donde se operan dos tipos de MS secuencialmente. ^{[ 74 ]} Cuando el instrumento HPLC está conectado a más de un detector, se llama sistema LC acoplado. Las aplicaciones farmacéuticas ^[⁷⁵^] son los principales usuarios de HPLC, LC-MS y LC-MS/MS. ^[⁷⁶^] Esto incluye el desarrollo de fármacos ^[⁷⁷^] y la farmacología, que es el estudio científico de los efectos de los fármacos y las sustancias químicas en los organismos vivos, ^[⁷⁸^] la medicina personalizada, ^[⁷⁹^] la salud pública ^[⁸⁰^]^[⁸¹^] y el diagnóstico. ^[⁸²^] Si bien la orina es el medio más común para analizar las concentraciones de fármacos, el suero sanguíneo es la muestra que se recoge para la mayoría de los análisis médicos con HPLC. ^[⁸³^] Uno de los roles más importantes de LC-MS y LC-MS/MS en el laboratorio clínico es el cribado neonatal (NBS) para trastornos metabólicos ^[⁸⁴^] y diagnósticos de seguimiento. ^[⁸⁵^]^[⁸⁶^] Las muestras de los bebés vienen en forma de gota de sangre seca (DBS), ^[⁸⁷^] que es simple de preparar y transportar, lo que permite diagnósticos seguros y accesibles, tanto a nivel local como global.

Se han probado otros métodos de detección de moléculas útiles para estudios clínicos frente a la HPLC, concretamente los inmunoensayos. En un ejemplo de ello, se compararon los ensayos de unión competitiva a proteínas (CPBA) y la HPLC en cuanto a su sensibilidad para la detección de vitamina D. Útil para diagnosticar deficiencias de vitamina D en niños, se encontró que la sensibilidad y la especificidad de este CPBA alcanzaban solo el 40 % y el 60 %, respectivamente, de la capacidad de la HPLC. ^{[ 88 ]} Si bien es una herramienta costosa, la precisión de la HPLC es prácticamente inigualable.

Véase también

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