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Articulo de referencia

Calorimetría de titulación isotérmica

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MicroCal. VP-ITC en una caja de guantes.

En termodinámica química , la calorimetría de titulación isotérmica ( ITC ) es una técnica física utilizada para determinar los parámetros termodinámicos de las interacciones en solución . [ 1 ] [ 2 ] La ITC es la única técnica capaz de caracterizar de forma integral los perfiles termodinámicos y cinéticos de una interacción molecular mediante la determinación simultánea de las constantes de unión (Ka{\displaystyle K_{a}}), estequiometría de la reacción (norte{\displaystyle n}), entalpía (ΔH{\displaystyle \Delta H}), energía libre de Gibbs (ΔGRAMO{\displaystyle \Delta G}) y entropía (ΔS{\displaystyle \Delta S}) dentro de un solo experimento. [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ] Consiste en dos celdas que están encerradas en una camisa adiabática . [ 7 ]

Los compuestos a estudiar se colocan en la celda de muestra, mientras que la otra celda, la celda de referencia, se utiliza como control y contiene el tampón en el que se disuelve la muestra. [ 8 ] La técnica cuantifica el calor liberado o absorbido durante el proceso de unión añadiendo incrementalmente un reactivo (mediante una jeringa) a otro (en la celda de muestra) manteniendo constante la temperatura y la presión. [ 3 ] [ 9 ] Los dispositivos de detección de calor dentro del ITC detectan variaciones de temperatura entre dos celdas, transmitiendo esta información a calentadores que se ajustan en consecuencia para restaurar el equilibrio térmico entre las celdas. [ 3 ] Esta energía se convierte en entalpía de unión utilizando la información sobre las concentraciones de los reactivos y el volumen de la celda. [ 6 ] En comparación con otros calorímetros , el ITC no requiere correctores ya que no hay intercambio de calor entre el sistema y el entorno. El ITC también es altamente sensible con un tiempo de respuesta rápido y se beneficia de modestos requisitos de muestra. [ 6 ] Si bien la calorimetría diferencial de barrido (DSC) también puede proporcionar información directa sobre la termodinámica de las interacciones de unión, la ITC ofrece la capacidad adicional de cuantificar la termodinámica de la unión de iones metálicos a proteínas. [ 5 ]

Historia de las TIC

La historia de la ITC se remonta a la década de 1930, cuando se utilizó la calorimetría isotérmica para estudiar reacciones químicas . [ 10 ] En 1965, Christensen e Izatt introdujeron la calorimetría de titulación como un método para determinar simultáneamente la constante de equilibrio y la entalpía . [ 3 ] [ 11 ] La técnica ITC fue desarrollada posteriormente por HD Johnston en 1968 como parte de su tesis doctoral en la Universidad Brigham Young, [ 12 ] y se consideró un nicho hasta que MicroCal Inc. la introdujo comercialmente . en 1988. En 1978, Beaudette y Langerman llevaron a cabo uno de los primeros estudios de unión calorimétrica utilizando un calorímetro de titulación isoperibólica de pequeño volumen [ 11 ] y una década después, en 1989, Wiseman, Williston, Brandts y Lin demostraron su aplicación en sistemas biológicos , marcando el comienzo de la calorimetría de titulación como una valiosa herramienta para estudiar los equilibrios biológicos. [ 10 ] Originalmente, la ITC se utilizaba con mayor frecuencia para estudiar la unión de moléculas pequeñas (como compuestos medicinales) a macromoléculas más grandes ( proteínas , ADN, etc.) en un entorno sin marcadores. [ 4 ] [ 13 ] [ 14 ] Su aplicación se ha ampliado ahora, ayudada por mejoras modernas, lo que permite medir efectos de calor tan pequeños como 0,1 μcal (0,4 μJ) y determinar constantes de unión (K) tan altas como 10 8 –10 9 M −1 . [ 5 ] [ 11 ]

Mediciones termodinámicas

Termograma ITC; el panel superior izquierdo muestra la curva de titulación; el panel inferior izquierdo muestra el termograma ITC correspondiente; el panel derecho muestra el termograma ITC con diferentes valores de c.

La ITC es una técnica cuantitativa que puede determinar la afinidad de unión (Ka{\displaystyle K_{a}}), entalpía de reacción (ΔH{\displaystyle \Delta H}), y estequiometría de unión (norte{\displaystyle n}) de la interacción entre dos o más moléculas en solución. [ 15 ] Esto se logra midiendo las entalpías de una serie de reacciones de unión causadas por inyecciones de una solución de una molécula en una celda de reacción que contiene una solución de otra molécula. [ 9 ] Los valores de entalpía se grafican sobre las relaciones molares resultantes de las inyecciones. [ 16 ] A partir de la gráfica, la entalpía molar de reacciónΔH{\displaystyle \Delta H}, la constante de afinidad (Ka{\displaystyle K_{a}}) y la estequiometría se determinan mediante ajuste de curvas . [ 5 ] [ 15 ] El cambio de energía libre de Gibbs de la reacción (ΔGRAMO{\displaystyle \Delta G}) y cambio de entropía (ΔS{\displaystyle \Delta S}) se puede determinar utilizando la relación:

ΔGRAMO=−RTln⁡Ka=ΔH−TΔS{\displaystyle \Delta G=-RT\ln {K_{a}}=\Delta HT\Delta S}

(dóndeR{\displaystyle R}es la constante de los gases yT{\displaystyle T}es la temperatura absoluta ).

Para obtener mediciones precisas de la afinidad de unión, la curva del termograma debe ser sigmoidal. Una curva sigmoidal pronunciada indica una unión fuerte, mientras que una curva sigmoidal menos pronunciada apunta a una unión más débil. [ 4 ] El perfil de la curva está determinado por el valor c, que se calcula mediante la siguiente ecuación:

do=norteKaMETRO{\displaystyle c=nK_{a}M}

dóndenorte{\displaystyle n}es la estequiometría de la unión,Ka{\displaystyle K_{a}}es la constante de asociación yMETRO{\displaystyle M}es la concentración de la molécula en la célula. [ 1 ] [ 17 ] [ 18 ] El valor c debe estar entre 1 y 1000, idealmente entre 10 y 100. En términos de afinidad de unión, sería aproximadamente de1.0×103{\displaystyle 1.0\times 10^{3}}~107{\displaystyle 10^{7}}dentro del rango límite. [ 19 ] Si no se encuentra dentro del rango anterior, los valores termodinámicos obtenidos del experimento son menos robustos para la interpretación.

Mediciones instrumentales

Esquema de un instrumento ITC que muestra la celda de referencia, la celda de muestra y la inyección de ligando.

Un calorímetro de titulación isotérmica se compone de dos celdas idénticas hechas de un material altamente conductor térmicamente e inerte químicamente, como la aleación Hastelloy o el oro, rodeadas por una camisa adiabática . [ 1 ] [ 18 ] En esta configuración, una de las celdas, la celda de muestra, contiene la solución de un reactivo, y la otra celda, la celda de referencia, se llena con un tampón o agua. [ 3 ]

El segundo reactivo, que tiene una concentración mayor que el primero, se coloca en una jeringa y se inyecta gradualmente en la celda de muestra en pequeñas alícuotas durante todo el proceso de titulación. [ 7 ] Este proceso es semiautomatizado y se utilizan circuitos sensibles de termopila/termopar para detectar diferencias de temperatura entre la celda de referencia (llena de tampón o agua) y la celda de muestra que contiene la macromolécula. [ 9 ] Antes de la adición del ligando,  se aplica una potencia constante (<1 mW) a la celda de referencia. Esto dirige un circuito de retroalimentación, activando un calentador ubicado en la celda de muestra. [ 17 ] Durante el experimento, el ligando se titula en la celda de muestra en alícuotas conocidas con precisión, lo que provoca que se absorba o se libere calor (dependiendo de la naturaleza de la reacción). [ 9 ] Las mediciones consisten en la entrada dependiente del tiempo de potencia necesaria para mantener temperaturas iguales entre las celdas de muestra y de referencia. [ 7 ] [ 12 ]

Titulación gradual de un reactivo (en la jeringa) en otro reactivo (en la celda de muestra).

En una reacción exotérmica , la temperatura en la celda de muestra aumenta al añadir el ligando . Esto provoca que la potencia de retroalimentación a la celda de muestra disminuya (recordemos que se aplica una potencia de referencia a la celda de referencia) para mantener una temperatura igual entre ambas celdas. [ 7 ] En una reacción endotérmica , ocurre lo contrario; el circuito de retroalimentación aumenta la potencia para mantener una temperatura constante (funcionamiento isotérmico). [ 1 ]

Las observaciones se representan gráficamente como la potencia necesaria para mantener la celda de referencia y la celda de muestra a una temperatura idéntica en función del tiempo. [ 7 ] Como resultado, los datos experimentales brutos consisten en una serie de picos de flujo de calor (potencia), donde cada pico corresponde a una inyección de ligando . [ 15 ] Estos picos/pulsos de flujo de calor se integran con respecto al tiempo, lo que da el calor total intercambiado por inyección. [ 16 ] Al integrar cada pico desde la línea base, se obtiene el calor total asociado con cada inyección, incluyendo tanto las contribuciones específicas de la reacción como las no relacionadas con la reacción. [ 3 ] El patrón de estos efectos de calor en función de la relación molar [ligando]/[macromolécula] puede analizarse para obtener los parámetros termodinámicos de la interacción en estudio. [ 4 ]

Procedimientos experimentales

Ejemplo de configuración de parámetros experimentales para ITC, incluyendo número de inyecciones, volumen de inyección inicial, volúmenes de inyección subsiguientes, temperatura, potencia de referencia, velocidad de agitación, espaciado, retardo inicial y período de filtrado.

Para medir con exactitud y precisión los parámetros termodinámicos mediante ITC, se deben seguir ciertos procedimientos, que incluyen la configuración del instrumento, la configuración de parámetros, la carga de la muestra, la selección del tampón y la limpieza del instrumento. [ 6 ] [ 11 ] [ 16 ] Para obtener un resultado óptimo, se debe dar tiempo suficiente a cada inyección para que se alcance el equilibrio de reacción . [ 8 ] A menudo es necesario desgasificar las muestras para obtener buenas mediciones, ya que la presencia de burbujas de gas dentro de la celda de muestra dará lugar a gráficos de datos anómalos en los resultados registrados. Todo el experimento se lleva a cabo bajo control informático. [ 6 ] [ 18 ]

La titulación directa se realiza más comúnmente con ITC para obtener datos termodinámicos, mediante la unión directa de dos componentes de la reacción entre sí. Sin embargo, muchas de las reacciones químicas e interacciones de unión pueden tener una afinidad de unión mayor que la deseable con la ventana c. [ 7 ] Para solucionar la limitación de la ventana c y las condiciones para ciertas interacciones de unión, se pueden realizar varios métodos de titulación diferentes. [ 15 ] En algunos casos, simplemente realizar una titulación inversa cambiando las muestras entre la jeringa de inyección y la celda de muestra puede resolver el problema, dependiendo del mecanismo de unión. Sin embargo, el proceso de introducir un ligando a una macromolécula es distinto del proceso de añadir una macromolécula a un ligando. [ 15 ] Si bien el equilibrio de unión permanece inalterado tanto en las titulaciones directas como inversas, la ruta hacia el equilibrio y los estados de unión accesibles varían, particularmente cuando una molécula posee múltiples sitios de unión para la otra. [ 3 ] La mayoría de las uniones de alta o baja afinidad requieren quelación o titulación competitiva. [ 15 ] Este método se realiza cargando una solución de complejo pre-unido en la celda de muestra y quelando uno de los componentes con un reactivo de mayor afinidad de unión observada dentro de la ventana c deseada.

Para garantizar una estabilidad óptima del instrumento, el instrumento ITC debe encenderse al menos un día antes de su uso. Idealmente, las muestras deben preequilibrarse a aproximadamente 2  °C por debajo de la temperatura experimental objetivo para reducir el tiempo de estabilización después de la carga, aunque comenzar a la temperatura experimental exacta también es una opción. [ 8 ] Para la limpieza del instrumento, la celda de muestra debe enjuagarse con el tampón experimental y secarse al vacío, y cualquier solución de enjuague restante debe desecharse manualmente con una jeringa. Luego, la celda de muestra se llena con la solución experimental y la celda de referencia con agua de alta pureza o el mismo tampón. [ 4 ] Para evitar la contaminación por aire, se utilizan jeringas Hamilton herméticas, asegurándose de que la aguja esté posicionada cerca del fondo de la celda de muestra antes de dispensar el líquido lentamente. [ 8 ] Los parámetros experimentales, como el número de inyecciones, el volumen de inyección inicial, los volúmenes de inyección subsiguientes, la temperatura, la potencia de referencia, la velocidad de agitación, el espaciado, el retardo inicial y el período de filtrado, deben ajustarse según el estudio específico. [ 7 ]

Si se va a repetir el experimento, la jeringa debe vaciarse y la solución debe desecharse o guardarse para su posterior análisis. Antes de rellenarla con la misma solución, la aguja de la jeringa debe enjuagarse externamente y secarse con papel sin pelusa, sin necesidad de un lavado interno. [ 8 ] Sin embargo, al cambiar a un reactivo o concentración diferente, la jeringa debe lavarse a fondo, enjuagarse con etanol o metanol y secarse cuidadosamente al vacío, utilizando un ThermoVac para VP-ITC o los sistemas de vacío integrados en otros modelos. La celda de muestra debe vaciarse utilizando la jeringa de carga y enjuagarse varias veces con agua. [ 11 ]

Análisis e interpretación

Análisis post-hoc e inventario de protones

Es necesario realizar un análisis post-hoc para determinar la entalpía independiente del tampón o del disolvente a partir de la termodinámica experimental. Los datos experimentales recopilados reflejan no solo la termodinámica de unión de la interacción de interés, sino también cualquier equilibrio competitivo que contribuya asociado a ella. [ 5 ] [ 15 ] [ 16 ] Se puede realizar un análisis post-hoc para determinar la entalpía independiente del tampón o del disolvente a partir de la termodinámica experimental, simplemente siguiendo el proceso de la ley de Hess . [ 5 ] [ 10 ] [ 15 ] El siguiente ejemplo muestra una interacción simple entre un ion metálico (M) y un ligando (L). B representa el tampón utilizado para esta interacción yH+{\displaystyle {\ce {H+}}}representa protones .

METRO−B↽−−⇀METRO+B{\displaystyle {\ce {M - B <=> M + B}}}−ΔHMEGABYTE{\displaystyle {\ce {-\Delta H_ {MB}}}}

L−H↽−−⇀L+H+{\displaystyle {\ce {L - H <=> L + H+}}}−(norteH+)ΔHLH{\displaystyle -(n_{H+})\Delta H_{LH}}

H++B↽−−⇀H−B{\displaystyle {\ce {H+ + B <=> H - B}}}(norteH+)ΔHBH{\displaystyle (n_{H+})\Delta H_{BH}}

METRO+L↽−−⇀METRO−L{\displaystyle {\ce {M + L <=> M - L}}}ΔHMETROL{\displaystyle \Delta H_{ML}}

Ejemplo de un gráfico de inventario de protones de una interacción de unión. Se presentan los valores entálpicos promedio obtenidos en tres condiciones de tampón diferentes ( TAPSO , bis-Tris y HEPES ). Los ejes X e Y representan la entalpía de protonación del tampón y la entalpía observada en los experimentos realizados, respectivamente.

Por lo tanto,

ΔHITdo=−ΔHMETROB−(norteH+)ΔHLH+(norteH+)ΔHBH+ΔHMETROL{\displaystyle \Delta H_{ITC}=-\Delta H_{MB}-(n_{H+})\Delta H_{LH}+(n_{H+})\Delta H_{BH}+\Delta H_{ML}}

que se puede procesar aún más para calcular la entalpía de interacción metal-ligando. [ 20 ] [ 21 ] Aunque este ejemplo es entre un metal y un ligando , es aplicable a cualquier experimento de ITC, en lo que respecta a interacciones de unión.

Como parte del análisis, se requiere un número de protones para calcular la termodinámica independiente del disolvente. [ 15 ] Esto se puede hacer fácilmente trazando un gráfico como el que se muestra a continuación.

La ecuación lineal de esta gráfica es la versión reordenada de la ecuación anterior del análisis post-hoc en la forma y = mx + b:

ΔHITdo=(norteH+)ΔHBH+[−ΔHMETROB−(norteH+)ΔHLH+ΔHMETROL]{\displaystyle \Delta H_{ITC}=(n_{H+})\Delta H_{BH}+[-\Delta H_{MB}-(n_{H+})\Delta H_{LH}+\Delta H_{ML}]}

Constante de equilibrio

La constante de equilibrio de la reacción tampoco es independiente de los otros equilibrios competitivos. [ 5 ] La competencia incluiría interacciones de tampón y otras reacciones dependientes del pH según las condiciones experimentales. [ 5 ] [ 15 ] La competencia de especies distintas a la especie de interés se incluye en el factor de competencia, Q en la siguiente ecuación: [ 21 ]

Q=Σ(βnorte[incógnita]norte){\displaystyle Q=\Sigma (\beta _{n}[\mathrm {X} ]_{n})}

dónde,incógnita{\displaystyle X}representa especies como un amortiguador o protones,β{\displaystyle \beta }representa su constante de equilibrio, cuando,

KMETROL=KITdoQ{\displaystyle K_{ML}=K_{ITC}Q}

Aplicaciones

Durante los últimos 30 años, la calorimetría de titulación isotérmica se ha utilizado en una amplia gama de campos, desde estudios de unión de metales hasta descubrimiento de fármacos e investigación de nanomateriales . [ 9 ] [ 16 ] [ 22 ] [ 23 ] Antiguamente, esta técnica se utilizaba para determinar valores termodinámicos fundamentales para interacciones moleculares pequeñas básicas. [ 24 ] En los últimos años, la ITC se ha utilizado en áreas más aplicables industrialmente, como el descubrimiento de fármacos y las pruebas de materiales sintéticos . [ 9 ] Aunque todavía se utiliza mucho en química fundamental, la tendencia se ha desplazado hacia el lado biológico, donde los valores sin marcadores e independientes del tampón son relativamente más difíciles de obtener. [ 9 ] [ 25 ] [ 26 ]

Cinética enzimática

Utilizando los datos termodinámicos de ITC, es posible deducir la cinética enzimática, incluyendo la transferencia de protones o electrones , la alostería y la cooperatividad , y la inhibición enzimática . [ 8 ] [ 27 ] [ 28 ] [ 29 ] Los instrumentos modernos de ITC pueden medir tasas de calor tan pequeñas como 0,1 μcal/seg, lo que permite la determinación precisa de las tasas de reacción en el rango de 10 −12 mol/seg y ITC puede determinar valores para Km y kcat, en los rangos de 10 −2 –10 3 μM y 0,05–500 s −1 , respectivamente. [ 11 ] ITC recopila datos a lo largo del tiempo que son útiles para cualquier experimento cinético, pero especialmente con las proteínas debido a las alícuotas constantes de las inyecciones. [ 30 ] En términos de cálculo, la constante de equilibrio y las pendientes de unión pueden utilizarse directamente para determinar la alostería y la transferencia de carga, comparando datos experimentales de diferentes condiciones ( pH , uso de cadena peptídica mutada y sitios de unión, etc.). [ 11 ] Se ha encontrado que los datos cinéticos obtenidos de ITC se alinean estrechamente con los resultados de otros métodos puramente cinéticos, como la resonancia de plasmones superficiales. [ 3 ]

Estudios sobre membranas y péptidos autoensamblables

Las proteínas de membrana y las propiedades de autoensamblaje de ciertas proteínas pueden estudiarse mediante esta técnica, debido a que es un calorímetro sin marcadores . [ 16 ] Se sabe que las proteínas de membrana presentan dificultades para seleccionar protocolos adecuados de solubilización y purificación. Como la ITC es una herramienta calorimétrica no destructiva, puede utilizarse como detector para localizar la fracción de proteína con los sitios de unión deseados, mediante la unión de un ligando de unión conocido a la proteína. [ 16 ] [ 31 ] Esta característica también se aplica en estudios de proteínas autoensamblables, especialmente en el uso de la medición de la termodinámica de su transformación estructural. [ 32 ]

Desarrollo de fármacos

La ITC puede proporcionar información sobre el desarrollo de fármacos al caracterizar la afinidad, la selectividad, los cambios conformacionales inducidos por el ligando y la partición del fármaco en las membranas. [ 16 ] La afinidad de unión tiene una gran importancia en la química medicinal , ya que los fármacos deben unirse a la proteína de manera efectiva dentro de un rango deseado. Un proceso de unión exotérmico con una entalpía favorable se considera una característica deseable para los ligandos de proteínas específicos, ya que indica un fuerte potencial de optimización y alta selectividad. [ 3 ] Sin embargo, determinar los cambios de entalpía y la optimización de los parámetros termodinámicos es extremadamente difícil al diseñar fármacos. [ 9 ] La ITC resuelve este problema fácilmente al deducir la afinidad de unión, las contribuciones entálpicas/entrópicas y su estequiometría de unión.

Química quiral

Aplicando las ideas anteriores, la quiralidad de los compuestos organometálicos también puede deducirse con esta técnica. [ 33 ] Cada compuesto quiral posee propiedades y mecanismos de unión únicos, comparables entre sí, lo que genera diferencias en sus propiedades termodinámicas. Al unir soluciones quirales a un sitio de unión, se puede deducir el tipo de quiralidad y, según el propósito, determinar qué compuesto quiral es más adecuado para la unión.

interacciones de unión de metales

La unión de iones metálicos a proteínas y otros componentes del material biológico es uno de los usos más populares de la ITC, desde el estudio de unión de ovotransferrina a hierro férrico publicado por Lin et al. de MicroCal Inc. [ 34 ] Esto se debe a que algunos de los iones metálicos utilizados en sistemas biológicos tienen una configuración electrónica d10 que no puede estudiarse con otras técnicas comunes como la espectrofotometría UV-vis o la resonancia paramagnética electrónica . [ 19 ] [ 20 ] También está estrechamente relacionada con estudios bioquímicos y medicinales debido a la gran abundancia de enzimas que se unen a metales en los sistemas biológicos. [ 35 ]

La técnica se ha utilizado ampliamente en el estudio de nanotubos de carbono para determinar interacciones de unión termodinámicas con moléculas biológicas e interacciones de compuestos de grafeno . [ 36 ] Otro uso notable de ITC con nanotubos de carbono es la optimización de la preparación de nanotubos de carbono a partir de compuestos de grafeno y alcohol polivinílico (PVA) . El proceso de ensamblaje de PVA se puede medir termodinámicamente, ya que la mezcla de los dos ingredientes es una reacción exotérmica, y su tendencia de unión se puede observar fácilmente mediante ITC.

Interacciones entre nanopartículas y proteínas

La ITC se utiliza cada vez más para estudiar las interacciones proteína-nanopartícula, ya que proporciona información clave sobre la afinidad de unión (en forma de constante de asociación), los mecanismos de interacción (cuantificados mediante la entalpía de unión, la entropía de unión y la energía libre de Gibbs) y la estequiometría de unión. [ 22 ] Estos parámetros termodinámicos de la ITC pueden ayudar a evaluar las modificaciones estructurales en las proteínas tras la adsorción en superficies de nanopartículas . [ 23 ]

Limitaciones

Una de las principales limitaciones de la ITC es que tiende a permitir la detección únicamente de conformaciones de unión moderadas, lo que la hace menos eficaz para detectar eventos de unión muy débiles o extremadamente fuertes. [ 16 ] Por lo tanto, puede tener dificultades para proporcionar parámetros termodinámicos precisos para procesos cinéticos lentos con constantes de tiempo largas, ya que estas interacciones pueden quedar enmascaradas por el ruido de fondo y la variabilidad. [ 3 ] Por otro lado, las interacciones de alta afinidad pueden ser difíciles de medir si tardan varios minutos o más en desarrollarse por completo, o si la señal medida depende de la entalpía de reacción. [ 37 ] Cuando la entalpía de unión es cercana a cero, la ITC puede no generar datos de interacción significativos, produciendo en su lugar una serie de picos pequeños y uniformes que dan como resultado termogramas planos y poco informativos. [ 3 ]

La ITC también es susceptible a la interferencia de señales térmicas no relacionadas, lo que dificulta aislar e interpretar los cambios de calor asociados con la interacción de interés. [ 15 ] [ 16 ] Otras limitaciones incluyen restricciones de solubilidad, dificultades para determinar con precisión la concentración de proteínas y la necesidad de preparar el ligando en las mismas condiciones de solución que la proteína para obtener mediciones fiables. [ 15 ]

Véase también

Referencias

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