Etiqueta de afinidad codificada con isótopos

Una etiqueta de afinidad codificada con isótopos ( ICAT ) es un método de marcaje isotópico in vitro utilizado para la proteómica cuantitativa mediante espectrometría de masas que emplea reactivos de marcaje químico . ^{[ 1 ] [ 2 ] [ 3 ]} Estas sondas químicas constan de tres elementos: un grupo reactivo para marcar una cadena lateral de aminoácidos (p. ej., yodoacetamida para modificar residuos de cisteína ), un enlazador codificado isotópicamente y una etiqueta (p. ej., biotina ) para el aislamiento por afinidad de proteínas/péptidos marcados. Las muestras se combinan y luego se separan mediante cromatografía, y posteriormente se envían a un espectrómetro de masas para determinar la relación masa-carga entre las proteínas. Solo se pueden analizar péptidos que contienen cisteína. Dado que solo se analizan péptidos que contienen cisteína, a menudo se pierde la modificación postraduccional. ^{[ 4 ]}

Las etiquetas originales se desarrollaron utilizando deuterio , pero posteriormente el mismo grupo rediseñó las etiquetas utilizando 13C en su lugar para evitar problemas de separación de picos durante la cromatografía líquida debido a la interacción del deuterio con la fase estacionaria de la columna. ^{[ 5 ]}

Para la comparación cuantitativa de dos proteomas, una muestra se marca con la sonda isotópica ligera (d0) y la otra con la versión isotópica pesada (d8). Para minimizar el error, ambas muestras se combinan, se digieren con una proteasa (es decir, tripsina ) y se someten a cromatografía de afinidad con avidina para aislar péptidos marcados con reactivos de marcaje codificados isotópicamente. Estos péptidos se analizan posteriormente mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS). Se cuantifican las proporciones de intensidades de señal de pares de péptidos marcados con masas diferenciales para determinar los niveles relativos de proteínas en las dos muestras.