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Kodecyte

Un kodecito (ko•de•cito) es una célula viva que ha sido modificada (koded) mediante la incorporación de una o más estructuras lipídicas espaciadoras funcionales (estructuras FSL...

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Un kodecito (ko•de•cito) es una célula viva que ha sido modificada (koded) mediante la incorporación de una o más estructuras lipídicas espaciadoras funcionales (estructuras FSL) [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] para adquirir una nueva función biológica, química o tecnológica. La célula se modifica mediante la incorporación de la cola lipídica de la estructura FSL a la membrana bilipídica celular.

Todos los kodecitos conservan su vitalidad y funcionalidad normales al tiempo que adquieren la nueva función de las estructuras FSL insertadas. La combinación de dispersibilidad en medios biocompatibles , incorporación espontánea a las membranas celulares y aparente baja toxicidad, hace que las estructuras FSL sean idóneas como herramientas de investigación y para el desarrollo de nuevas aplicaciones diagnósticas y terapéuticas .

La tecnología

Analogía estructural de un girasol con modelos de relleno espacial de construcciones FSL seleccionadas. Las dos construcciones FSL de la izquierda son péptidos FSL basados ​​en espaciadores de oligoglicina parcialmente carboximetilada (CMG2) con lípidos 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE). La tercera y cuarta construcción son biotina FSL basada en CMG pero con lípidos DOPE y esterol (derivado del ácido δ-oxicarbonilaminovalérico del colesterol ), respectivamente. La última construcción FSL es un trisacárido típico, conjugado mediante un espaciador O(CH2 ) 3NH a un derivado de adipato activado del lípido diacil DOPE.

Las construcciones Kode FSL constan de tres componentes; [ 3 ] [ 4 ] una porción funcional (F), un espaciador (S) y un lípido (L).

Los grupos funcionales en los constructos FSL que se pueden usar para crear kodecitos incluyen sacáridos (incluidos determinantes relacionados con el grupo sanguíneo ABO , [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ] ácidos siálicos , polisacáridos de hialuronina ), fluoróforos , [ 7 ] [ 8 ] biotina , [ 9 ] y una variedad de péptidos . [ 10 ] [ 11 ] [ 12 ] [ 13 ] [ 14 ] [ 15 ] [ 16 ] [ 17 ] [ 18 ]

Aunque los kodecitos se crean modificando células naturales, difieren de estas. Por ejemplo, las construcciones FSL, influenciadas por la composición de la cola lipídica, presentan movilidad lateral en la membrana, y algunas pueden agruparse debido a las características del grupo funcional (F). [ 1 ] Dado que las construcciones FSL se anclan a la membrana mediante una cola lipídica (L), se cree que no participan en la transducción de señales , sino que pueden estar diseñadas para actuar como agonistas o antagonistas del evento de unión inicial. Las construcciones FSL no atraviesan activamente la membrana plasmática, pero pueden entrar en la célula mediante invaginación de membrana y endocitosis. [ 7 ]

La "codificación" de las células es estable (sujeta a la tasa de recambio de los componentes de la membrana). Los constructos FSL permanecerán en la membrana de las células inactivas (por ejemplo, glóbulos rojos) durante la vida de la célula, siempre que se almacene en medios libres de lípidos. [ 7 ] En la circulación periférica, se observa que los constructos FSL se pierden de los kodecitos de los glóbulos rojos a una tasa de aproximadamente el 1 % por hora. [ 9 ] [ 19 ] La dosis inicial de "codificación" y el nivel mínimo requerido para la detección determinan cuánto tiempo se puede monitorizar la presencia de "kodecitos" en la circulación. Para los "kodecitos" de los glóbulos rojos, se ha demostrado una monitorización fiable de la presencia de los "kodecitos" hasta 3 días después de la administración intravenosa en pequeños mamíferos. [ 9 ]

El espaciador (S) de una construcción FSL se ha seleccionado para que tenga una reactividad cruzada insignificante con los anticuerpos del suero, de modo que los kodecitos puedan utilizarse con suero sin diluir. Se ha demostrado que al aumentar la longitud del espaciador FSL de 1,9 a 7,2 nm , la sensibilidad puede duplicarse en los ensayos de kodecitos basados ​​en la aglutinación de glóbulos rojos. Sin embargo, aumentar aún más el tamaño del espaciador de 7,2 a 11,5  nm no produjo ninguna mejora adicional. [ 1 ]

Una membrana plasmática modificada con estructuras FSL (por analogía con el girasol), creando una membrana de kodecito.

Vídeo de tecnología

Para ver un vídeo sencillo que explica cómo funciona la tecnología Kode, haga clic en el siguiente enlace: https://www.youtube.com/watch?v=TIbjAl5KYpA

Metodología

Preparación de los kodecitos. Simplemente mezcle las células con una solución de FSL (que contenga uno o más FSL) e incube durante 10 a 120 minutos a 37  °C (o a temperaturas tan bajas como 4  °C). Los constructos se incorporarán espontáneamente a la membrana y no se requieren pasos adicionales.

Los constructos FSL, cuando están en solución (solución salina ) y en contacto, se incorporarán espontáneamente a las membranas celulares. [ 20 ] La metodología consiste simplemente en preparar una solución de constructos FSL en el rango de 1–1000 μg / mL , donde la concentración utilizada determina la cantidad de antígeno presente en el kodecito. La capacidad de controlar los niveles de antígeno en el exterior de un kodecito ha permitido la fabricación de sistemas de sensibilidad de control de calidad [ 2 ] y kits de enseñanza serológica que incorporan toda la gama de reacciones de aglutinación serológica. [ 21 ] La concentración real dependerá del constructo y la cantidad de constructo requerida en la membrana. Se agrega una parte de solución FSL a una parte de células (hasta 100% de suspensión ) y se incuban a una temperatura establecida dentro del rango de 4–37 °C (39–99 °F) dependiendo de la compatibilidad de temperatura de las células que se están modificando. Cuanto mayor sea la temperatura, más rápida será la velocidad de inserción de FSL en la membrana. Para los glóbulos rojos, la incubación durante 2 horas a 37 °C logra una inserción de FSL >95%, alcanzándose al menos un 50% de inserción en 20 minutos. En general, para la inserción de FSL basados ​​en carbohidratos en glóbulos rojos, la incubación durante 4 horas a temperatura ambiente o 20 horas a 4 °C es similar a una hora a 37 °C. [ 20 ] Los kodecitos resultantes no requieren lavado; sin embargo, esta opción debe considerarse si se utiliza un exceso de constructo FSL en el proceso de "coding".     

Los kodecitos también pueden crearse in vivo mediante la inyección de constructos directamente en la circulación. [ 19 ] Sin embargo, este proceso modificará todas las células en contacto con los constructos y generalmente requiere una cantidad significativamente mayor de constructo que la preparación in vitro , ya que los constructos FSL se asociarán preferentemente con lípidos libres. [ 19 ] La creación in vivo de kodecitos no es selectiva y los constructos FSL se insertarán en todas las células de forma inespecífica, pero pueden mostrar preferencia por algunos tipos celulares.

Los análisis serológicos de diagnóstico [ 4 ], incluyendo la citometría de flujo [ 5 ] y la microscopía electrónica de barrido, generalmente no pueden ver una diferencia entre los "kodecitos" y las células no modificadas. Sin embargo, al compararlos con células naturales, sí parece haber una diferencia entre las reactividades de los anticuerpos IgM e IgG cuando el grupo funcional (F) es un antígeno peptídico monomérico. Los anticuerpos IgM parecen reaccionar débilmente con los kodecitos hechos con péptidos FSL. [ 10 ] [ 17 ] Además, los constructos FSL pueden tener un antígeno/epítopo restringido y pueden no reaccionar con un anticuerpo monoclonal a menos que el constructo FSL y el anticuerpo monoclonal sean complementarios. [ 10 ] [ 17 ]

Los kodecitos pueden estudiarse mediante técnicas histológicas estándar. Los kodecitos pueden fijarse después de la "codificación", siempre que la porción funcional (F) del constructo FSL sea compatible con el fijador. Sin embargo, se requieren tejidos congelados o congelados fijados con formalina, ya que los constructos FSL basados ​​en lípidos (y otros glucolípidos) se lixiviarán de los "kodecitos" en muestras incluidas en parafina durante los pasos de desparafinación. [ 20 ]

Nomenclatura

Las membranas codificadas se describen por el constructo y la concentración de FSL (en μg / mL ) utilizada para crearlas. [ 20 ] Por ejemplo, los kodecitos creados con una solución de 100 μg/mL de FSL-A se denominarían kodecitos A100. Si se utilizaron múltiples constructos de FSL, la definición se amplía en consecuencia, por ejemplo, los kodecitos A100+B300 se crean con una solución que contiene 100 μg/mL de FSL-A y 300 μg/mL de FSL-B. El símbolo "+" se utiliza para separar las mezclas de constructos, por ejemplo, A100+B300. Si las concentraciones de FSL son constantes, se puede omitir el componente μg/mL de la terminología, por ejemplo, kodecitos A. Alternativamente, construcciones no relacionadas como FSL-A y FSL-biotina crearán kodecitos A+biotina, etc. Si se utilizan células diferentes en el mismo estudio, se recomienda incluir el tipo de célula en el nombre, por ejemplo, kodecitos A100 de glóbulos rojos frente a kodecitos A100 de glóbulos blancos, o kodecitos A100 de plaquetas, etc.

Aplicaciones

La tecnología Kode se ha utilizado para la modificación in vitro de embriones murinos , espermatozoides , peces cebra , células epiteliales / endometriales y glóbulos rojos [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] [ 8 ] [ 11 ] [ 12 ] [ 22 ] para crear sistemas de control de calidad celular, [ 2 ] [ 3 ] [ 10 ] kits serológicos (enseñanza), [ 21 ] [ 23 ] expresión de antígenos raros , agregar marcadores infecciosos a las células, [ 3 ] [ 13 ] [ 18 ] adhesión/interacción/separación/inmovilización celular modificada, [ 3 ] [ 7 ] [ 9 ] y etiquetado. [ 5 ] [ 8 ] También se ha infundido intravascularmente para la modificación in vivo de células sanguíneas y la neutralización de anticuerpos circulantes [ 3 ] [ 19 ] [ 24 ] y en imágenes in vivo de kodecitos de médula ósea circulantes en pez cebra. [ 25 ] Los constructos Kode FSL también se han aplicado a superficies no biológicas como celulosa modificada, papel, [ 22 ] sílice, polímeros, fibras naturales, vidrio y metales y se ha demostrado que son ultrarrápidos en el etiquetado de estas superficies. [ 3 ] [ 26 ]

Véase también

Referencias

  1. 1 2 3 Korchagina, Elena; Tuzikov, Alexander; Formanovsky, Andrey; Popova, Inna; Henry, Stephen; Bovin, Nicolai (2012). "Hacia la creación de paisajes de glicosilación de membranas celulares con construcciones de lípidos de glicanos". Carbohydrate Research . 356 : 238–46 . doi : 10.1016/j.carres.2012.03.044 . PMID 22551471 . 
  2. 1 2 3 Henry, Stephen M (2009). "Modificación de glóbulos rojos para uso en control de calidad de laboratorio". Current Opinion in Hematology . 16 (6): 467– 472. doi : 10.1097/MOH.0b013e328331257e . PMID 19680123 . S2CID 37416831 .  
  3. 1 2 3 4 5 6 7 8 Korchagina, EY; Henry, SM (2015-07-16). "Construcciones sintéticas similares a glicolípidos como herramientas para la investigación en glicobiología, diagnósticos y como posibles terapias". Biochemistry (Moscow) . 80 (7): 857– 871. doi : 10.1134/S0006297915070068 . ISSN 0006-2979 . PMID 26542000. S2CID 14965044 .   
  4. 1 2 3 4 Frame, Tom; Carroll, Tim; Korchagina, Elena; Bovin, Nicolai; Henry, Stephen (2007). "Modificación de glicolípidos sintéticos de las membranas de los glóbulos rojos". Transfusion . 47 (5): 876– 882. CiteSeerX 10.1.1.494.2776 . doi : 10.1111/j.1537-2995.2007.01204.x . PMID 17465953 . S2CID 18086433 .   
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