cuantificación sin marcadores

La cuantificación sin marcaje es un método de espectrometría de masas que busca determinar la cantidad relativa de proteínas en dos o más muestras biológicas . A diferencia de otros métodos de cuantificación de proteínas , la cuantificación sin marcaje no utiliza un compuesto que contenga un isótopo estable para unirse químicamente a la proteína y, por lo tanto, marcarla. ^{[ 1 ] [ 2 ]}

La cuantificación sin marcadores puede basarse en la intensidad de la señal precursora o en el recuento espectral . El primer método es útil cuando se aplica a espectros de masas de alta precisión, como los obtenidos con la nueva generación de analizadores de masas de tiempo de vuelo (ToF), resonancia ciclotrónica de iones por transformada de Fourier (FTICR) u Orbitrap . La alta resolución facilita la extracción de señales de péptidos a nivel MS1 ^y , por lo tanto, desacopla la cuantificación del proceso de identificación. En cambio, el recuento espectral simplemente cuenta el número de espectros identificados para un péptido dado en diferentes muestras biológicas y luego integra los resultados para todos los péptidos medidos de la(s) proteína(s) que se cuantifican.

El marco computacional del enfoque sin marcadores incluye la detección de péptidos, la comparación de los péptidos correspondientes en múltiples datos de LC-MS y la selección de péptidos discriminatorios. ^{[ 3 ] [ 4 ]}

La espectrometría de expresión de proteínas intactas (IPEx) es un método de cuantificación sin marcadores en espectrometría de masas que está siendo desarrollado por el grupo de química analítica del Centro para la Seguridad Alimentaria y la Nutrición Aplicada de la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) y otros centros. Las proteínas intactas se analizan mediante un instrumento LC-MS , generalmente un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo cuadrupolar en modo de perfil, y el perfil proteico completo se determina y cuantifica utilizando un software de reducción de datos. Los primeros resultados son muy alentadores. En un estudio, dos grupos de réplicas de tratamiento de muestras de mamíferos (organismos diferentes con historiales de tratamiento similares, pero no réplicas técnicas) muestran docenas de biomarcadores proteicos de bajo coeficiente de variación (CV), lo que sugiere que IPEx es una tecnología viable para estudiar la expresión de proteínas. ^{[ 5 ]}

Normalmente, las señales de péptidos se detectan a nivel MS1 y se distinguen del ruido químico mediante su patrón isotópico característico. Estos patrones se rastrean a lo largo del tiempo de retención y se utilizan para reconstruir el perfil de elución cromatográfica de la masa del péptido monoisotópico. La corriente iónica total de la señal del péptido se integra y se utiliza como medida cuantitativa de la concentración original del péptido. Para cada péptido detectado, primero se encuentran todos los picos isotópicos y luego se asigna su estado de carga.

La cuantificación sin marcadores puede basarse en la intensidad de la señal precursora y presenta problemas debido a la interferencia del aislamiento: en estudios de alto rendimiento, el ion precursor del péptido que se mide podría ser fácilmente un péptido completamente diferente con una relación m/z similar y que eluye en un intervalo de tiempo que se superpone con el del péptido anterior. El recuento espectral presenta problemas debido a que los péptidos se identifican, lo que hace necesario realizar un escaneo MS/MS adicional que consume tiempo y, por lo tanto, reduce la resolución del experimento.

A diferencia del marcaje diferencial, en un experimento sin marcaje cada muestra biológica debe medirse por separado. Las señales de péptidos extraídas se mapean a través de varias mediciones de LC-MS utilizando sus coordenadas en las dimensiones de masa-carga y tiempo de retención. Los datos de instrumentos de alta precisión de masa facilitan enormemente este proceso y aumentan la certeza de la correcta correspondencia de las señales de péptidos entre las distintas ejecuciones.

Evidentemente, el procesamiento diferencial de muestras biológicas exige contar con un estándar que permita ajustar los resultados. Para ello, pueden utilizarse péptidos cuyos niveles de expresión no se prevé que varíen en diferentes muestras biológicas. Sin embargo, no todos los péptidos se ionizan correctamente, por lo que la selección de candidatos debe realizarse tras un estudio inicial que se limite a caracterizar el contenido proteico de las muestras biológicas que se analizarán.

Finalmente, se emplean métodos de normalización sofisticados para eliminar los artefactos sistemáticos en los valores de intensidad de los péptidos entre las mediciones de LC-MS. A continuación, se identifican los péptidos discriminatorios seleccionando aquellos cuyas intensidades normalizadas difieren (p. ej., valor p < 0,05) entre varios grupos de muestras.

Además, los espectrómetros de masas híbridos más recientes, como el LTQ OrbiTrap, ofrecen la posibilidad de obtener identificaciones de péptidos mediante MS/MS en paralelo a la medición de alta precisión de masas de péptidos a nivel MS1. Esto plantea un desafío computacional para el procesamiento e integración de estas dos fuentes de información y ha propiciado el desarrollo de nuevas y prometedoras estrategias de cuantificación.