microdisección por captura láser

La microdisección por captura láser ( LCM ), también llamada microdisección , microdisección láser ( LMD ) o microdisección asistida por láser ( LMD o LAM ), es un método para aislar células específicas de interés de regiones microscópicas de tejido /células/ organismos ^{[ 1 ] [ 2 ]} ( disección a escala microscópica con la ayuda de un láser ).

La microdisección por captura láser (LCM) es un método para obtener subpoblaciones de células tisulares bajo visualización microscópica directa. La tecnología LCM permite recolectar directamente las células de interés o aislar células específicas eliminando las no deseadas para obtener poblaciones celulares enriquecidas histológicamente puras. Existen diversas aplicaciones posteriores: genotipado de ADN y análisis de pérdida de heterocigosidad (LOH), perfilado de transcritos de ARN , generación de bibliotecas de ADNc , descubrimiento proteómico y perfilado de vías de señalización. El tiempo total requerido para llevar a cabo este protocolo suele ser de 1 a 1,5 horas. ^{[ 3 ]}

Un láser se acopla a un microscopio y se enfoca sobre el tejido en la lámina portaobjetos. Mediante el movimiento del láser por la óptica o la platina, el foco sigue una trayectoria predefinida por el usuario. Esta trayectoria, también llamada elemento , se recorta y se separa del tejido adyacente. Tras el recorte, si se desea extraer el tejido, se procede a la extracción. Las tecnologías más recientes utilizan la microdisección sin contacto.

Existen varias formas de extraer tejido de una lámina portaobjetos con una muestra histopatológica . Una opción es presionar una superficie adhesiva sobre la muestra y retirarla. Esto extrae la región deseada, pero también puede eliminar partículas o tejido no deseado de la superficie, ya que esta no es selectiva. Otra opción es fundir una membrana de plástico sobre la muestra y retirarla. El calor se introduce, por ejemplo, mediante un láser rojo o infrarrojo (IR) sobre una membrana teñida con un colorante absorbente. Dado que esto adhiere la muestra deseada a la membrana, al igual que con cualquier membrana que se coloque cerca de la superficie de la muestra histopatológica, es posible que se extraigan algunos residuos. Otro peligro reside en el calor introducido: algunas moléculas, como el ADN, el ARN o las proteínas, no toleran un calentamiento excesivo o nulo para lograr un aislamiento lo más puro posible.

Para el transporte sin contacto. Existen tres enfoques diferentes. Transporte por gravedad mediante un microscopio vertical (denominado GAM, microdisección asistida por gravedad ) o transporte mediante catapulta láser de presión ; la generación más reciente utiliza una tecnología basada en la transferencia directa inducida por láser (LIFT). Con el método de corte y captura, una tapa recubierta con un adhesivo se coloca directamente sobre la  sección de tejido finamente cortada (5-8 μm), la cual descansa sobre una membrana delgada (polietileno naftaleno). Un láser IR calienta suavemente el adhesivo de la tapa, fusionándolo con el tejido subyacente, y un láser UV corta el tejido y la membrana subyacente. La entidad membrana-tejido se adhiere a la tapa y las células en ella pueden utilizarse en aplicaciones posteriores (análisis de ADN, ARN y proteínas). ^{[ 4 ]}

Bajo un microscopio con una interfaz de software, se observa una sección de tejido (típicamente de 5 a 50 micrómetros de espesor) y se identifican células individuales o grupos de células de forma manual, semiautomática o totalmente automatizada, lo que permite la obtención de imágenes y la selección automática de objetivos para su aislamiento. Actualmente existen seis tecnologías principales de aislamiento/recolección que utilizan un microscopio y un dispositivo para el aislamiento celular. Cuatro de ellas suelen utilizar un láser pulsado ultravioleta (355  nm) para cortar directamente los tejidos o las membranas/películas, y a veces en combinación con un láser infrarrojo responsable de calentar/fundir un polímero adhesivo para la adhesión y el aislamiento celular. El láser infrarrojo proporciona un método más suave para la microdisección. Una quinta tecnología basada en láser ultravioleta utiliza portaobjetos especiales recubiertos con una capa de transferencia de energía que, al activarse con el pulso láser, impulsa el tejido o las células hacia una tapa de recolección.

El ancho de corte láser suele ser inferior a 1  μm, por lo que las células objetivo no se ven afectadas por el haz láser. Incluso las células vivas no sufren daños durante el corte láser y son viables después del corte para su clonación y recultivo, según corresponda. ^{[ 5 ]}

Las distintas tecnologías difieren en el proceso de recolección, los posibles métodos de imagen ( microscopía de fluorescencia , microscopía de campo claro , microscopía de contraste de interferencia diferencial , microscopía de contraste de fase , etc.) y los tipos de soportes y preparación de tejidos necesarios antes de la obtención de imágenes y el aislamiento. La mayoría son principalmente sistemas dedicados a la microdisección, y algunos también pueden utilizarse como microscopios de investigación. Solo una tecnología (la número 2 en este caso, Leica) utiliza un microscopio vertical, lo que limita en cierta medida las capacidades de manipulación de muestras, especialmente para el trabajo con células vivas.

La primera tecnología (utilizada por Carl Zeiss PALM) corta alrededor de la muestra y luego la recoge mediante una tecnología de "catapultación". La muestra se puede catapultar desde un portaobjetos o una placa de cultivo especial mediante un pulso láser UV desenfocado que genera una fuerza fotónica para impulsar el material fuera del portaobjetos/placa, una técnica a veces denominada Catapulta de Presión por Microdisección Láser (LMPC). El material disecado se envía hacia arriba (hasta varios milímetros) a la tapa de un tubo de microcentrífuga u otro colector que contiene un tampón o un material adhesivo especializado en la tapa del tubo al que se adherirá el tejido. Este proceso de catapulta activa evita algunos de los problemas estáticos que se producen al utilizar portaobjetos recubiertos con membrana. ^{[ 6 ]}

Otro proceso sigue el método de microdisección asistida por gravedad, que aprovecha la gravedad para recolectar muestras en la tapa del tubo debajo del portaobjetos utilizado (empleado por el sistema ION LMD , Jungwoo F&B). En este sistema, la platina motorizada se mueve para cortar las células de interés, manteniendo el haz láser fijo. El sistema utiliza un láser de estado sólido  de 355 nm ( UV-A ), que es la forma más segura de cortar los tejidos sin dañar el ARN o el ADN. ^{[ 7 ]}

Otro proceso LCM estrechamente relacionado (utilizado por Leica) corta la muestra desde arriba y esta cae por gravedad (microdisección asistida por gravedad) en un dispositivo de captura situado debajo de la muestra. ^{[ 8 ]} La diferencia con el anterior radica en que, en este caso, el haz láser se mueve para cortar el tejido mediante un espejo dicroico móvil.

Cuando las células de interés (en un portaobjetos o placa de cultivo especial) se encuentran en el centro del campo de visión, el operador las selecciona mediante el software del instrumento. El área a aislar se delimita mediante un láser de infrarrojo cercano que activa la película de transferencia en una tapa colocada sobre la muestra de tejido, fundiendo el adhesivo que luego fusiona la película con las células subyacentes de interés (véase el sistema Arcturus); y/o mediante la activación de un láser UV para recortar la célula de interés. A continuación, las células se retiran de la fina sección de tejido, dejando atrás las células no deseadas. Las células de interés se visualizan y documentan antes de su extracción. ^{[ 9 ]}

La cuarta tecnología basada en UV (utilizada por Molecular Machines and Industries AG) ofrece una ligera diferencia con respecto a la tercera tecnología, ya que crea esencialmente una especie de sándwich con portaobjetos > muestra > y membrana que recubre la muestra mediante el uso de un portaobjetos con marco cuya superficie de membrana es cortada por el láser y finalmente recogida desde arriba por una tapa adhesiva especial. ^{[ 10 ]}

Una quinta tecnología basada en UV utiliza portaobjetos de vidrio estándar recubiertos con una capa inerte de transferencia de energía y un sistema de microdisección láser UV (normalmente una máquina Leica LMD o PALM Zeiss). Las secciones de tejido se montan sobre la capa de transferencia de energía. La energía del láser UV se convierte en energía cinética al impactar sobre la capa, vaporizándola e impulsando instantáneamente las características de tejido seleccionadas hacia el tubo de recolección. Los portaobjetos con recubrimiento de transferencia de energía, comercializados bajo la marca DIRECTOR por Expression Pathology Inc. (Rockville, MD), ofrecen varias ventajas para el trabajo proteómico. Además, no presentan autofluorescencia, por lo que pueden utilizarse en aplicaciones con tinciones fluorescentes, DIC o luz polarizada. ^{[ 11 ]}

Además de en secciones de tejido, la microdisección láser (LCM) se puede realizar en células/organismos vivos, frotis celulares, preparaciones cromosómicas y tejido vegetal.

El proceso de microdisección por captura láser no altera ni daña la morfología ni la química de la muestra recolectada, ni las células circundantes. Por esta razón, la LCM es un método útil para recolectar células seleccionadas para análisis de ADN , ARN y/o proteínas . La LCM también se ha utilizado para aislar estructuras acelulares, como placas amiloides . ^{[ 12 ]} La LCM se puede realizar en una variedad de muestras de tejido , incluyendo frotis de sangre , preparaciones citológicas, ^{[ 13 ]} cultivos celulares y alícuotas de tejido sólido. También se puede utilizar tejido de archivo congelado e incluido en parafina. ^{[ 14 ]}

A partir de 2025, existen dos proveedores principales de sistemas de microdisección asistida por láser: Leica Microsystems y MMI. Zeiss y Arcturus, proveedores que antes eran importantes, han descontinuado sus respectivos sistemas.

• Universidad de East Carolina: LCM para principiantes
• Proyecto Atlas Transcripcional Yale-Rice que emplea microdisección por captura láser