Caracterización de la bicapa lipídica

La caracterización de bicapas lipídicas consiste en el uso de diversos métodos de análisis óptico, químico y físico para estudiar sus propiedades. Muchas de estas técnicas son complejas y requieren equipos costosos, ya que la naturaleza fundamental de la bicapa lipídica la convierte en una estructura muy difícil de estudiar. Una bicapa individual, al tener solo unos pocos nanómetros de espesor, es invisible en la microscopía óptica tradicional. Además, la bicapa es una estructura relativamente frágil, puesto que se mantiene unida completamente por enlaces no covalentes y se destruye irreversiblemente si se extrae del agua. A pesar de estas limitaciones, en los últimos setenta años se han desarrollado docenas de técnicas para permitir la investigación de la estructura y función de las bicapas. El primer enfoque general consistió en utilizar mediciones in situ no destructivas , como la difracción de rayos X y la resistencia eléctrica, que medían las propiedades de la bicapa, pero no la visualizaban directamente. Posteriormente, se desarrollaron protocolos para modificar la bicapa y permitir su visualización directa, primero en el microscopio electrónico y, más recientemente, con microscopía de fluorescencia . En las últimas dos décadas, una nueva generación de herramientas de caracterización, como la microscopía de fuerza atómica (AFM), ha permitido el análisis y la obtención de imágenes directas de membranas in situ con escasa o nula modificación química o física. Más recientemente, se ha utilizado la interferometría de doble polarización para medir la birrefringencia óptica de bicapas lipídicas y caracterizar el orden y la alteración asociados a interacciones o efectos ambientales.

La microscopía de fluorescencia es una técnica que permite excitar ciertas moléculas con una longitud de onda de luz específica, las cuales emiten luz de mayor longitud de onda. Dado que cada molécula fluorescente posee un espectro único de absorción y emisión , es posible determinar la ubicación de tipos específicos de moléculas. Los lípidos naturales no presentan fluorescencia, por lo que siempre es necesario incluir una molécula de colorante para estudiar las bicapas lipídicas mediante microscopía de fluorescencia. En cierta medida, la adición de la molécula de colorante modifica el sistema, y ​​en algunos casos puede resultar difícil determinar si el efecto observado se debe a los lípidos, al colorante o, más comúnmente, a una combinación de ambos. El colorante suele estar unido a un lípido o a una molécula similar, pero dado que el dominio del colorante es relativamente grande, puede alterar el comportamiento de esta otra molécula. Este es un tema particularmente controvertido al estudiar la difusión o la separación de fases de los lípidos, ya que ambos procesos son muy sensibles al tamaño y la forma de las moléculas involucradas.

Esta posible complicación ha sido un argumento en contra del uso de la recuperación de fluorescencia tras fotoblanqueo (FRAP) para determinar los coeficientes de difusión de la bicapa. En un experimento FRAP típico, una pequeña  área (~30 μm de diámetro) se fotoblanquea mediante la exposición a una fuente de luz intensa. Esta área se monitoriza a lo largo del tiempo a medida que las moléculas de colorante "muertas" se difunden y son reemplazadas por moléculas de colorante intactas de la bicapa circundante. Ajustando esta curva de recuperación, es posible calcular el coeficiente de difusión de la bicapa. ^{[ 1 ] [ 2 ]} Un argumento en contra del uso de esta técnica es que lo que realmente se estudia es la difusión del colorante, no del lípido. ^{[ 3 ]} Si bien es cierto, esta distinción no siempre es importante, ya que la movilidad del colorante suele estar dominada por la movilidad de la bicapa.

En la microscopía de fluorescencia tradicional, la resolución se ha limitado a aproximadamente la mitad de la longitud de onda de la luz utilizada. Mediante el uso de microscopía confocal y procesamiento de imágenes, este límite puede ampliarse, pero normalmente no mucho menos de 100 nanómetros, que es mucho más pequeño que una célula típica pero mucho mayor que el grosor de una bicapa lipídica. Más recientemente, los métodos avanzados de microscopía han permitido una resolución mucho mayor en ciertas circunstancias, incluso hasta subnanométrica. Uno de los primeros métodos en desarrollarse fue la transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET). En FRET, se eligen dos moléculas de colorante de manera que el espectro de emisión de una se superponga al espectro de absorción de la otra. Esta transferencia de energía depende en gran medida de la distancia, por lo que es posible determinar con resolución de angstrom la distancia entre los dos colorantes. Esto puede utilizarse, por ejemplo, para determinar cuándo se fusionan dos bicapas y se mezclan sus componentes. ^{[ 4 ]} Otra técnica de microscopía de alta resolución es la microscopía de contraste de interferencia de fluorescencia (FLIC). Este método requiere que la muestra se monte sobre una superficie reflectante micromecanizada con precisión. Al estudiar los patrones de interferencia destructiva formados, es posible resolver individualmente las dos capas de una bicapa soportada y determinar la distribución de un colorante fluorescente en cada una. ^{[ 5 ]}

Las mediciones eléctricas son la forma más directa de caracterizar una de las funciones más importantes de una bicapa, a saber, su capacidad para segregar e impedir el flujo de iones en solución. Por consiguiente, la caracterización eléctrica fue una de las primeras herramientas utilizadas para estudiar las propiedades de sistemas modelo como las membranas negras. Ya se sabía que la membrana celular era capaz de mantener un gradiente iónico y que este gradiente es responsable de la capacidad de las neuronas para enviar señales mediante un potencial de acción . Demostrar que fenómenos similares podían replicarse in vitro fue una verificación importante de la utilidad de los sistemas modelo. ^{[ 6 ]}

Fundamentalmente, todas las mediciones eléctricas de bicapas implican la colocación de un electrodo a cada lado de la membrana. Al aplicar una polarización a través de estos electrodos y medir la corriente resultante, es posible determinar la resistencia de la bicapa. Esta resistencia suele ser bastante alta para bicapas intactas, a menudo superando los 100 GΩ, ya que el núcleo hidrofóbico es impermeable a las especies hidratadas cargadas. Debido a que esta resistencia es tan grande, la presencia de incluso unos pocos agujeros a escala nanométrica produce un aumento drástico de la corriente y puede detectarse fácilmente. ^{[ 7 ]} La sensibilidad de este sistema es tal que incluso se puede resolver la actividad de canales iónicos individuales. ^{[ 8 ]} En tales mediciones de CC, es necesario utilizar electrodos electroquímicamente activos para proporcionar las cargas positivas necesarias en un lado y cargas negativas en el otro. El sistema más común es el electrodo de plata/cloruro de plata, ya que esta reacción es estable, reversible, implica una transferencia de un solo electrón y puede producir grandes corrientes. ^{[ 9 ]} Además de las simples mediciones de corriente continua, también es posible realizar una caracterización eléctrica de corriente alterna para obtener información sobre la capacitancia y la impedancia compleja de una bicapa. Dado que la capacitancia es inversamente proporcional al espesor y las bicapas son muy delgadas, suelen tener una capacitancia muy alta, del orden de 2  μF/cm² ^. Las mediciones de capacitancia son particularmente útiles al trabajar con membranas lipídicas negras, ya que pueden utilizarse para determinar cuándo el tapón de disolvente/lípido se reduce a una sola bicapa.

Los lípidos son moléculas altamente polares que, al autoensamblarse en bicapas, crean una capa altamente birrefringente ^{[ 10 ]} donde las propiedades ópticas paralelas son muy diferentes de las perpendiculares. Este efecto, estudiado mediante interferometría de doble polarización, se ha utilizado para medir la reorganización dinámica de la capa debido a la temperatura, la fuerza iónica y las interacciones moleculares con, por ejemplo, péptidos antimicrobianos .

Las bicapas hidratadas presentan una rica dinámica vibracional y son buenos medios para la transferencia eficiente de energía vibracional. Las propiedades vibracionales de las monocapas y bicapas lipídicas se han investigado mediante técnicas espectroscópicas ultrarrápidas ^{[ 11 ]} y métodos computacionales desarrollados recientemente ^{[ 12 ] .}

La microscopía de fuerza atómica (AFM) se ha utilizado en los últimos años para obtener imágenes y analizar las propiedades físicas de las bicapas lipídicas. La AFM es una técnica prometedora porque tiene el potencial de obtener imágenes con resolución nanométrica a temperatura ambiente e incluso bajo el agua, condiciones necesarias para el comportamiento natural de la bicapa. Estas capacidades han permitido la obtención de imágenes directas de la sutil transición de fase ondulada en una bicapa soportada. ^{[ 13 ]} Otro experimento de AFM realizado en modo de contacto intermitente bajo un medio tampón acuoso permitió (1) determinar la formación de poros transmembrana (agujeros) alrededor de nanopartículas de aproximadamente 1,2 a 22  nm de diámetro mediante la sustracción de imágenes de AFM de series registradas durante la formación de la bicapa lipídica y (2) observar la adsorción de moléculas individuales de insulina sobre nanopartículas expuestas. ^{[ 14 ]} Otra ventaja es que la AFM no requiere el marcaje fluorescente o isotópico de los lípidos, ya que la punta de la sonda interactúa mecánicamente con la superficie de la bicapa. Debido a esto, el mismo escaneo puede revelar información tanto sobre la bicapa como sobre cualquier estructura asociada, incluso hasta el punto de resolver proteínas de membrana individuales. ^{[ 15 ]} Además de la obtención de imágenes, la AFM también puede investigar la naturaleza mecánica de estructuras pequeñas y delicadas, como las bicapas lipídicas. Un estudio demostró la posibilidad de medir el módulo elástico de membranas individuales a nanoescala suspendidas sobre alúmina anódica porosa. ^{[ 16 ]}

Aunque la AFM es una herramienta potente y versátil para el estudio de bicapas lipídicas, presenta algunas limitaciones y dificultades prácticas. Debido a la fragilidad de la bicapa, se deben utilizar fuerzas de escaneo extremadamente bajas (típicamente 50 pN o menos ^{[ 13 ] [ 17 ]} ) para evitar daños. Esta consideración es particularmente importante al estudiar sistemas metaestables, como vesículas adsorbidas en un sustrato, ya que la punta de la AFM puede inducir rupturas y otros cambios estructurales. ^{[ 18 ]} También se debe tener cuidado al elegir un material y una preparación de superficie adecuados para la punta de la AFM, ya que las superficies hidrofóbicas pueden interactuar fuertemente con los lípidos y alterar la estructura de la bicapa. ^{[ 19 ]}

En la microscopía electrónica, un haz de electrones enfocados interactúa con la muestra en lugar de un haz de luz como en la microscopía tradicional. Los electrones tienen una longitud de onda mucho más corta que la luz, por lo que la microscopía electrónica tiene una resolución mucho mayor que la microscopía óptica, potencialmente hasta la escala atómica. Debido a que las bicapas lipídicas están organizadas a nivel molecular, esta mayor resolución ha sido invaluable. En 1960, cuando la estructura de la bicapa aún era objeto de debate, fue la microscopía electrónica la que ofreció la primera visualización directa de las dos capas opuestas. ^{[ 20 ]} Junto con las técnicas de congelación rápida, la microscopía electrónica también se ha utilizado para estudiar los mecanismos de transporte inter e intracelular, por ejemplo, para demostrar que las vesículas exocíticas son el medio de liberación química en las sinapsis . ^{[ 21 ]} A menudo, la microscopía electrónica es la única técnica de sonda con la resolución suficiente para determinar morfologías complejas a escala nanométrica.

Las limitaciones de la microscopía electrónica en el estudio de las estructuras lipídicas se relacionan principalmente con la preparación de la muestra. La mayoría de los microscopios electrónicos requieren que la muestra esté al vacío, lo cual es incompatible con la hidratación a temperatura ambiente. Para superar este problema, las muestras pueden ser analizadas en condiciones criogénicas con el agua asociada congelada, o bien se puede crear un negativo metálico a partir de una muestra congelada. También suele ser necesario teñir la bicapa con un compuesto de metal pesado, como el tetróxido de osmio o el acetato de uranilo, ya que los componentes de bajo peso atómico de los lípidos (carbono, nitrógeno, fósforo, etc.) ofrecen poco contraste en comparación con el agua. Si se utiliza un microscopio electrónico de transmisión (TEM), también es necesario cortar o pulir la muestra hasta obtener una lámina muy fina (<1 micrómetro), lo cual puede ser difícil y laborioso. La microscopía electrónica de barrido (SEM) no requiere este paso, pero no ofrece la misma resolución que el TEM. Ambos métodos son técnicas sensibles a la superficie y no pueden revelar información sobre estructuras profundamente enterradas.

Tanto los rayos X como los neutrones de alta energía se utilizan para investigar la estructura y periodicidad de estructuras biológicas, incluidas las bicapas, porque se pueden ajustar para interactuar con la materia en las escalas de longitud relevantes (angstrom-nm). A menudo, estas dos clases de experimentos proporcionan información complementaria porque cada una tiene diferentes ventajas y desventajas. Los rayos X interactúan débilmente con el agua, por lo que se pueden investigar muestras a granel con una preparación de muestra relativamente sencilla. Esta es una de las razones por las que la dispersión de rayos X fue la primera técnica utilizada para estudiar sistemáticamente el espaciado entre bicapas. ^{[ 22 ]} La dispersión de rayos X también puede proporcionar información sobre el espaciado promedio entre moléculas lipídicas individuales , lo que ha llevado a su uso en la caracterización de transiciones de fase . ^{[ 23 ]} Una limitación de las técnicas de rayos X es que los rayos X son relativamente insensibles a elementos ligeros como el hidrógeno. Este efecto es consecuencia del hecho de que los rayos X interactúan con la materia dispersándose en la densidad electrónica, que disminuye al disminuir el número atómico. En contraste, los neutrones se dispersan con la densidad nuclear y los campos magnéticos nucleares, por lo que la sensibilidad no disminuye monótonamente con z . Este mecanismo también proporciona un fuerte contraste isotópico en algunos casos, especialmente entre hidrógeno y deuterio , lo que permite a los investigadores ajustar la línea base experimental mezclando agua y agua deuterada. El uso de reflectometría en lugar de dispersión con neutrones o rayos X permite a los experimentadores sondear bicapas soportadas o pilas multicapa. Estas mediciones son más complejas de analizar, pero permiten determinar la composición de la sección transversal, incluyendo la ubicación y concentración de agua dentro de la bicapa. ^{[ 24 ]} En el caso de las mediciones de dispersión de neutrones y rayos X, la información proporcionada es un promedio de conjunto del sistema y, por lo tanto, está sujeta a incertidumbre basada en fluctuaciones térmicas en estas estructuras altamente móviles. ^{[ 25 ]}