Secuenciación de tercera generación

En comparación con la segunda generación de tecnologías de secuenciación, la secuenciación de tercera generación tiene la ventaja evidente de producir lecturas mucho más largas. Se espera que estas lecturas más largas alivien numerosos desafíos computacionales relacionados con el ensamblaje del genoma, la reconstrucción de transcripciones y la metagenómica, entre otras áreas importantes de la biología y la medicina modernas. ^{[ 2 ]}

Es bien sabido que los genomas eucariotas, incluidos los de primates y humanos, son complejos y poseen numerosas regiones repetidas de gran longitud. Las lecturas cortas de la secuenciación de segunda generación deben recurrir a estrategias aproximadas para inferir secuencias de largo alcance para el ensamblaje y la identificación de variantes genéticas. La secuenciación de segunda generación ha aprovechado las lecturas de extremos emparejados para superar estas limitaciones. Sin embargo, la longitud exacta de los fragmentos de extremos emparejados suele ser desconocida y también debe aproximarse. Al permitir lecturas de gran longitud, las tecnologías de secuenciación de tercera generación ofrecen claras ventajas.

Los marcadores epigenéticos son modificaciones estables y potencialmente hereditarias de la molécula de ADN que no se encuentran en su secuencia. Un ejemplo es la metilación del ADN en los sitios CpG , que se ha demostrado que influye en la expresión génica. Las modificaciones de las histonas son otro ejemplo. La generación actual de tecnologías de secuenciación se basa en técnicas de laboratorio como la secuenciación ChIP para la detección de marcadores epigenéticos. Estas técnicas implican el etiquetado de la cadena de ADN, la fragmentación y el filtrado de los fragmentos que contienen marcadores, seguidos de la secuenciación. La secuenciación de tercera generación puede permitir la detección directa de estos marcadores debido a su señal distintiva con respecto a las otras cuatro bases nucleotídicas. ^{[ 6 ]}

Otras ventajas importantes de las tecnologías de secuenciación de tercera generación incluyen la portabilidad y la velocidad de secuenciación. ^{[ 7 ]} Dado que se requiere un preprocesamiento mínimo de la muestra en comparación con la secuenciación de segunda generación, se podría diseñar un equipo más pequeño. Oxford Nanopore Technology ha comercializado recientemente el secuenciador MinION . Esta máquina de secuenciación tiene aproximadamente el tamaño de una memoria USB estándar y se puede usar fácilmente conectándola a una computadora portátil. Además, dado que el proceso de secuenciación no se paraleliza en todas las regiones del genoma, los datos se pueden recopilar y analizar en tiempo real. Estas ventajas de la secuenciación de tercera generación pueden ser muy adecuadas en entornos hospitalarios donde se requiere una recopilación y análisis de datos rápidos y en el sitio.

Cuando se dispone de un genoma de referencia , como en el caso del ser humano, las secuencias recién obtenidas pueden alinearse con dicho genoma para caracterizar sus propiedades. Este ensamblaje basado en la referencia es rápido y sencillo, pero tiene la desventaja de ocultar secuencias novedosas y variantes con un número elevado de copias . Además, la mayoría de los organismos aún no cuentan con genomas de referencia.

El ensamblaje de novo es una alternativa al alineamiento de referencia para el ensamblaje del genoma. Consiste en la reconstrucción de secuencias genómicas completas a partir de lecturas de secuencias sin procesar. Este método se elige cuando no se dispone de un genoma de referencia, cuando se desconoce la especie del organismo, como en metagenómica , o cuando existen variantes genéticas de interés que no se detectan mediante el alineamiento del genoma de referencia.

Dada la corta longitud de las lecturas producidas por la generación actual de tecnologías de secuenciación, el ensamblaje de novo representa un importante problema computacional . Normalmente se aborda mediante un proceso iterativo de búsqueda y conexión de lecturas de secuencia con solapamientos adecuados. Se han utilizado diversas técnicas computacionales y estadísticas, como los grafos de De Bruijn y los grafos de consenso de disposición de solapamiento, para resolver este problema. Sin embargo, debido a la naturaleza altamente repetitiva de los genomas eucariotas, la reconstrucción precisa y completa de las secuencias genómicas en el ensamblaje de novo sigue siendo un desafío. Las lecturas de extremos emparejados se han propuesto como una posible solución, aunque las longitudes exactas de los fragmentos suelen ser desconocidas y deben aproximarse. ^{[ 8 ]}

Las largas longitudes de lectura que ofrece la secuenciación de tercera generación pueden aliviar muchos de los desafíos que actualmente enfrentan los ensamblajes de genomas de novo. Por ejemplo, si una región repetitiva completa se puede secuenciar sin ambigüedad en una sola lectura, no se requeriría inferencia computacional. Se han propuesto métodos computacionales para mitigar el problema de las altas tasas de error. Por ejemplo, en un estudio, se demostró que el ensamblaje de novo de un genoma microbiano utilizando únicamente la secuenciación PacBio tuvo un rendimiento superior al de la secuenciación de segunda generación. ^{[ 9 ]}

La secuenciación de tercera generación también puede utilizarse junto con la secuenciación de segunda generación. Este enfoque se conoce comúnmente como secuenciación híbrida. Por ejemplo, las lecturas largas de la secuenciación de tercera generación pueden utilizarse para resolver ambigüedades presentes en genomas previamente ensamblados mediante secuenciación de segunda generación. Por otro lado, las lecturas cortas de segunda generación se han utilizado para corregir errores en las lecturas largas de tercera generación. En general, se ha demostrado que este enfoque híbrido mejora significativamente los ensamblajes de genomas de novo. ^{[ 10 ]}

Los métodos más comunes actualmente para examinar el estado de metilación requieren un ensayo que fragmenta el ADN antes de la secuenciación estándar de segunda generación en la plataforma Illumina . Debido a la corta longitud de las lecturas, se pierde información sobre los patrones de metilación más largos. ^{[ 6 ]} Las tecnologías de secuenciación de tercera generación ofrecen la capacidad de secuenciar en tiempo real una sola molécula con lecturas más largas y detectar modificaciones del ADN sin el ensayo mencionado. ^{[ 12 ]}

El MinION de Oxford Nanopore Technologies se ha utilizado para detectar la metilación del ADN (DNAm). A medida que cada hebra de ADN pasa a través de un poro, produce señales eléctricas que han demostrado ser sensibles a los cambios epigenéticos en los nucleótidos. Se utilizó un modelo oculto de Markov (HMM) para analizar los datos del MinION y detectar la modificación del ADN de 5-metilcitosina (5mC). ^{[ 6 ]} El modelo se entrenó utilizando ADN de E. coli metilado sintéticamente y las señales resultantes medidas por la tecnología de nanoporos. Posteriormente, el modelo entrenado se utilizó para detectar 5mC en lecturas genómicas del MinION de una línea celular humana que ya contaba con un metiloma de referencia. El clasificador tiene una precisión del 82 % en sitios únicos muestreados aleatoriamente, que aumenta al 95 % cuando se aplican umbrales más estrictos. ^{[ 6 ]}

Otros métodos abordan diferentes tipos de modificaciones del ADN utilizando la plataforma MinION. Stoiber et al. examinaron la 4-metilcitosina (4mC) y la 6-metiladenina (6mA), junto con la 5mC, y también crearon un software para visualizar directamente los datos brutos de MinION de forma comprensible para el usuario. ^{[ 13 ]} Allí encontraron que en E. coli , que tiene un metiloma conocido , se pueden usar ventanas de eventos de 5 pares de bases para dividir y analizar estadísticamente las señales eléctricas brutas de MinION. Una prueba U de Mann-Whitney simple puede detectar porciones modificadas de la secuencia de E. coli , así como dividir aún más las modificaciones en regiones de 4mC, 6mA o 5mC. ^{[ 13 ]}

Parece probable que, en el futuro, los datos brutos de MinION se utilicen para detectar muchas marcas epigenéticas diferentes en el ADN.

La secuenciación PacBio también se ha utilizado para detectar la metilación del ADN. En esta plataforma, el ancho del pulso (el ancho de un pulso de luz fluorescente) corresponde a una base específica. En 2010 se demostró que la distancia entre pulsos en muestras de control y metiladas es diferente, y que existe un ancho de pulso "firma" para cada tipo de metilación. ^{[ 12 ]} En 2012, utilizando la plataforma PacBio, se caracterizaron los sitios de unión de las ADN metiltransferasas . ^{[ 14 ]} La detección de la N6-metilación en C. elegans se demostró en 2015. ^{[ 15 ]} La metilación del ADN en N ⁶ -adenina utilizando la plataforma PacBio en células madre embrionarias de ratón se demostró en 2016. ^{[ 16 ]}

Otras formas de modificaciones del ADN, como las causadas por metales pesados, oxidación o daños por rayos UV, también son posibles vías de investigación utilizando la secuenciación de tercera generación de Oxford Nanopore y PacBio.

El procesamiento de los datos brutos, como la normalización a la señal mediana, fue necesario en los datos brutos de MinION, lo que redujo la capacidad en tiempo real de la tecnología. ^{[ 13 ]} La consistencia de las señales eléctricas sigue siendo un problema, lo que dificulta la identificación precisa de un nucleótido. MinION tiene un bajo rendimiento; dado que es difícil obtener múltiples lecturas superpuestas, esto genera aún más problemas de precisión en la detección posterior de modificaciones de ADN. Tanto el modelo oculto de Markov como los métodos estadísticos utilizados con los datos brutos de MinION requieren observaciones repetidas de modificaciones de ADN para su detección, lo que significa que los nucleótidos modificados individuales deben estar presentes de manera consistente en múltiples copias del genoma, por ejemplo, en múltiples células o plásmidos en la muestra.

En la plataforma PacBio, la cobertura necesaria también varía según el tipo de metilación que se espere encontrar. Hasta marzo de 2017, otros factores epigenéticos, como las modificaciones de histonas, no se podían detectar con tecnologías de tercera generación. Los patrones de metilación más largos suelen perderse porque aún es necesario ensamblar contigs más pequeños.

El empalme alternativo (EA) es el proceso por el cual un solo gen puede dar lugar a múltiples transcripciones de ARNm distintas y, en consecuencia, a diferentes traducciones de proteínas. ^{[ 18 ]} Algunas evidencias sugieren que el EA es un fenómeno ubicuo y puede desempeñar un papel clave en la determinación de los fenotipos de los organismos, especialmente en eucariotas complejos; todos los eucariotas contienen genes que constan de intrones que pueden sufrir EA. En particular, se ha estimado que el EA ocurre en el 95 % de todos los genes humanos multiexónicos. ^{[ 19 ]} El EA tiene un potencial innegable para influir en innumerables procesos biológicos. El avance del conocimiento en esta área tiene implicaciones críticas para el estudio de la biología en general.

La generación actual de tecnologías de secuenciación produce solo lecturas cortas, lo que impone una enorme limitación a la capacidad de detectar transcripciones distintas; las lecturas cortas deben ser reconstruidas mediante ingeniería inversa para obtener las transcripciones originales que podrían haber dado lugar a las observaciones de lectura resultantes. ^{[ 20 ]} Esta tarea se complica aún más por los niveles de expresión altamente variables entre transcripciones y, en consecuencia, por las coberturas de lectura variables a lo largo de la secuencia del gen. ^{[ 20 ]} Además, los exones pueden ser compartidos entre transcripciones individuales, lo que hace que las inferencias inequívocas sean prácticamente imposibles. ^{[ 18 ]} Los métodos computacionales existentes hacen inferencias basadas en la acumulación de lecturas cortas en varias ubicaciones de la secuencia, a menudo haciendo suposiciones simplificadoras. ^{[ 20 ]} Cufflinks adopta un enfoque parsimonioso, buscando explicar todas las lecturas con el menor número posible de transcripciones. ^{[ 21 ]} Por otro lado, StringTie intenta estimar simultáneamente las abundancias de transcripciones mientras ensambla las lecturas. ^{[ 20 ]} Estos métodos, aunque razonables, pueden no identificar siempre transcripciones reales.

Un estudio publicado en 2008 analizó 25 protocolos diferentes de reconstrucción de transcripciones existentes. ^{[ 17 ]} Su evidencia sugirió que los métodos existentes son generalmente débiles en el ensamblaje de transcripciones, aunque la capacidad de detectar exones individuales está relativamente intacta. ^{[ 17 ]} Según las estimaciones, la sensibilidad promedio para detectar exones en los 25 protocolos es del 80% para los genes de Caenorhabditis elegans . ^{[ 17 ]} En comparación, la sensibilidad de identificación de transcripciones disminuye al 65%. Para humanos, el estudio reportó una sensibilidad de detección de exones promedio del 69% y la sensibilidad de detección de transcripciones tuvo un promedio de apenas el 33%. ^{[ 17 ]} En otras palabras, para humanos, los métodos existentes son capaces de identificar menos de la mitad de todas las transcripciones existentes.

Las tecnologías de secuenciación de tercera generación han demostrado perspectivas prometedoras para resolver el problema de la detección de transcritos, así como la estimación de la abundancia de ARNm a nivel de transcritos. Si bien las tasas de error siguen siendo altas, las tecnologías de secuenciación de tercera generación tienen la capacidad de producir longitudes de lectura mucho mayores. ^{[ 22 ]} Pacific Bioscience ha introducido la plataforma iso-seq, que propone secuenciar moléculas de ARNm en su longitud completa. ^{[ 22 ]} Se prevé que Oxford Nanopore proponga tecnologías similares. El problema de las tasas de error más altas puede mitigarse mediante lecturas cortas suplementarias de alta calidad. Este enfoque se ha probado previamente y se ha informado que reduce la tasa de error en más de 3 veces. ^{[ 23 ]}

La principal ventaja de las tecnologías de secuenciación de tercera generación en metagenómica radica en su velocidad de secuenciación en comparación con las técnicas de segunda generación. La velocidad de secuenciación es importante, por ejemplo, en el ámbito clínico (es decir, en la identificación de patógenos ), para permitir un diagnóstico eficaz y una actuación clínica oportuna.

El MinION de Oxford Nanopore se utilizó en 2015 para la detección metagenómica en tiempo real de patógenos en muestras clínicas complejas con alto nivel de ruido de fondo. La primera lectura del virus del Ébola (EBOV) se secuenció 44 segundos después de la adquisición de datos . ^{[ 24 ]} Hubo un mapeo uniforme de las lecturas al genoma; al menos una lectura se mapeó a >88% del genoma. Las lecturas relativamente largas permitieron la secuenciación de un genoma viral casi completo con alta precisión (97-99% de identidad) directamente a partir de una muestra clínica primaria. ^{[ 24 ]}

Un marcador filogenético común para estudios de diversidad de comunidades microbianas es el gen del ARN ribosomal 16S . Tanto MinION como la plataforma SMRT de PacBio se han utilizado para secuenciar este gen. ^{[ 25 ] [ 26 ]} En este contexto, la tasa de error de PacBio fue comparable a la de lecturas más cortas de las plataformas de secuenciación 454 y MiSeq de Illumina.

La alta tasa de error de MinION (~10-40%) impidió la identificación de marcadores de resistencia antimicrobiana , para los cuales se requiere resolución de un solo nucleótido. Por la misma razón, no se identificaron patógenos eucariotas . ^{[ 24 ]} La facilidad de contaminación cruzada al reutilizar la misma celda de flujo (los protocolos de lavado estándar no funcionan) también es una preocupación. Los códigos de barras únicos podrían permitir una mayor multiplexación. Además, realizar una identificación precisa de especies para bacterias , hongos y parásitos es muy difícil, ya que comparten una mayor porción del genoma, y ​​algunos solo difieren en <5%.

El costo de secuenciación por base sigue siendo significativamente mayor que el de MiSeq. Sin embargo, la posibilidad de complementar las bases de datos de referencia con secuencias completas de organismos por debajo del límite de detección del método Sanger ; ^{[ 25 ]} esto podría ayudar enormemente a la identificación de organismos en metagenómica.