Tampón de lisis

Un tampón de lisis es una solución tampón que se utiliza para romper las células y emplearlas en experimentos de biología molecular que analizan las macromoléculas lábiles de las células (por ejemplo, Western blot para proteínas o para la extracción de ADN ). La mayoría de los tampones de lisis contienen sales tamponadoras (por ejemplo, Tris-HCl ) y sales iónicas (por ejemplo, NaCl ) para regular el pH y la osmolaridad del lisado . En ocasiones, se añaden detergentes (como Triton X-100 o SDS ) para romper las estructuras de la membrana. Para los tampones de lisis destinados a la extracción de proteínas , a menudo se incluyen inhibidores de proteasas , y en casos difíciles pueden ser casi imprescindibles. Los tampones de lisis pueden utilizarse tanto en células de tejidos animales como vegetales. ^{[ 1 ]}

El propósito principal del tampón de lisis es aislar las moléculas de interés y mantenerlas en un entorno estable. Para las proteínas, en algunos experimentos, las proteínas objetivo deben estar completamente desnaturalizadas , mientras que en otros experimentos deben permanecer plegadas y funcionales. Las diferentes proteínas también tienen diferentes propiedades y se encuentran en diferentes entornos celulares. Por lo tanto, es esencial elegir el mejor tampón según el propósito y el diseño de los experimentos. Los factores importantes a considerar son: pH, fuerza iónica , uso de detergente, inhibidores de proteasa para prevenir procesos proteolíticos. ^{[ 2 ]} Por ejemplo, la adición de detergente es necesaria cuando se lisan bacterias Gram negativas , pero no para bacterias Gram positivas . ^{[ 3 ]} Es común que se agregue un inhibidor de proteasa al tampón de lisis, junto con otros inhibidores enzimáticos de elección, como un inhibidor de fosfatasa cuando se estudian proteínas con fosforilación.

El tampón crea un entorno para las proteínas aisladas. Cada tampón tiene un rango de pH específico, por lo que debe elegirse en función de si la proteína objetivo del experimento es estable a un pH determinado. Además, para tampones con rangos de pH similares, es importante considerar si el tampón es compatible con la proteína objetivo del experimento. ^{[ 4 ]} La tabla siguiente contiene varios de los tampones más utilizados y sus rangos de pH. ^{[ 4 ]}

_El tampón de lisis generalmente contiene una o más sales. La función de las sales en el tampón de lisis es establecer una fuerza iónica en la solución tampón. Algunas de las sales más utilizadas son NaCl, KCl y (NH₄ ₎ ₂SO₄ _. Suelen utilizarse a una concentración de entre 50 y 150 mM. ^{[ 4 ]}

Los detergentes son tensioactivos orgánicos anfipáticos (con una cola hidrofóbica y una cabeza hidrofílica). Se utilizan para separar las proteínas de membrana de las membranas biológicas, ya que la parte hidrofóbica del detergente puede rodearlas y, por lo tanto, aislar las proteínas de membrana. ^{[ 5 ]} Si bien los detergentes son ampliamente utilizados y cumplen funciones similares, sus propiedades físicas y químicas deben considerarse en función de los objetivos del experimento.

Los detergentes suelen clasificarse como no iónicos, aniónicos, catiónicos o zwitteriónicos, según la característica de su grupo de cabeza hidrófilo. ^{[ 5 ]}

Los detergentes no iónicos como el Triton X-100 y los detergentes zwitteriónicos como el CHAPS (3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato) no son desnaturalizantes (no alteran las funciones de las proteínas). Los detergentes iónicos como el dodecilsulfato de sodio (SDS) y los detergentes catiónicos como el bromuro de etiltrimetilamonio son desnaturalizantes (alteran las funciones de las proteínas). ^{[ 6 ]} Los detergentes son un ingrediente principal que determina la fuerza de lisis de un tampón de lisis dado.

Un problema común al que se enfrentan muchos tampones de lisis celular es la alteración de las estructuras proteicas durante el proceso de lisis, causada en parte por el uso de detergentes. Los detergentes suelen impedir la restauración de las condiciones nativas necesarias para el correcto plegamiento de las proteínas . ^{[ 7 ]}

Durante mucho tiempo, después de una lisis celular basada en detergente, era necesario realizar un intercambio de tampón y/o diálisis para eliminar el detergente, entre otros compuestos que lo dificultaban, y así restaurar las condiciones nativas. ^{[ 8 ]}

Para superar este problema, ha surgido una solución: un tampón de lisis celular sin detergentes. El tampón GentleLys utiliza copolímeros en lugar de detergentes, lo que garantiza una lisis celular eficaz a la vez que mantiene el entorno nativo, fundamental para el correcto plegamiento de los componentes celulares, como las proteínas.

Otros aditivos incluyen iones metálicos, azúcares como la glucosa, glicerol, quelantes de metales (por ejemplo, EDTA ) y agentes reductores como el ditiotreitol (DTT). ^{[ 4 ]}

Puede que sea el tampón de lisis más utilizado. El agente solubilizante es NP-40 , que puede sustituirse por otros detergentes en diferentes concentraciones. Dado que el NP-40 es un detergente no iónico, este tampón de lisis tiene un efecto más suave que el tampón RIPA. Puede utilizarse cuando se desea conservar las funciones de las proteínas con una mínima alteración. ^{[ 9 ]}

Receta: ^{[ 9 ]}

• 150 mM NaCl
• 1,0% de Nonidet P-40 o Triton X-100
• 50 mM Tris-Cl
• Ajustar el pH a 7,4.

El tampón RIPA es un tampón de lisis comúnmente utilizado para la inmunoprecipitación y la extracción general de proteínas de células y tejidos. El tampón se puede almacenar sin vanadato a 4 °C durante un máximo de un año. ^{[ 10 ]} El tampón RIPA libera las proteínas de las células y también interrumpe la mayoría de las interacciones débiles entre proteínas. ^{[ 9 ]}

Receta: ^{[ 10 ]}

• 1% (p/p) Nonidet P-40 (NP-40)
• 1% (p/v) desoxicolato de sodio
• Ficha de datos de seguridad (SDS) al 0,1 % (p/v)
• 0,15 M NaCl
• fosfato de sodio 0,01 M, pH 7,2
• EDTA 2 mM
• 50 mM de fluoruro de sodio (NaF)
• 0,2 mM de ortovanadato de sodio fresco (Na ₃ VO ₄ .2H ₂ O, tiene función inhibidora de la fosfatasa porque imita al fosfato)
• 100 U/ml de inhibidor de proteasa, como la aprotinina

El SDS es un detergente desnaturalizante iónico. El tampón SDS caliente se usa frecuentemente cuando las proteínas necesitan ser completamente solubilizadas y desnaturalizadas.

Receta: ^{[ 10 ]}

• Ficha de datos de seguridad al 0,5 % (p/v)
• 0,05 M Tris⋅Cl
• Ajustar el pH a 8.0
• Agregar 1 mM de ditiotreitol (DTT) fresco.

ACK se utiliza para la lisis de glóbulos rojos en muestras biológicas donde otras células, como los glóbulos blancos, son de mayor interés. ^{[ 11 ]}

Receta: ^{[ 12 ] [ 13 ]}

• cloruro de amonio 150 mM
• bicarbonato de potasio 10 mM
• EDTA 0,1 mM
• Ajustar el pH a 7,2-7,4.

The GentleLys buffer employs synthetic nanodisc copolymers to gently disrupt the cell membrane, offering a milder alternative to conventional detergent-based lysis buffers. This gentle approach eliminates the need for harsh chemicals, creating an environment that preserves the native state of cellular proteins. Consequently, the proteins maintain their structural integrity and functionality, a marked departure from the denaturing effects of detergent-based buffers.

Cell lysis is a critical step in the purification of enzymes from bacterial cells, various components are commonly included in lysing buffers to facilitate effective cell disruption and release of the target enzyme. These components include detergents, salts, and enzymes, each playing a specific role in the lysis process. Examples of detergents used in lysing buffers include:

Detergents:

Detergents are amphipathic molecules that possess both hydrophilic and hydrophobic properties. In the context of cell lysis, detergents act by disrupting the lipid bilayer of the bacterial cell membrane, leading to membrane permeabilization and release of intracellular components, including the target enzyme.

Commonly used detergents in lysing buffers include:

a. Triton X-100: a nonionic detergent frequently employed due to its mild and effective membrane-disrupting properties, it solubilizes lipids and membrane proteins, allowing the release of intracellular contents.

b. Sodium dodecyl sulfate (SDS): an anionic detergent that denatures proteins by disrupting their secondary and tertiary structures, it solubilizes cellular membranes and aids in protein extraction.

c. Tween-20: a nonionic detergent is milder compared to SDS and Triton X-100. It assists in membrane permeabilization and solubilization of proteins without causing significant denaturation.

Salts:

Salts are crucial components of lysing buffers as they help maintain optimal cellular conditions and provide ionic strength to facilitate cell disruption.

Commonly used salts in lysing buffers include:

a. Sodium chloride (NaCl): NaCl is often included to maintain isotonic conditions, preventing osmotic shock and cell rupture during the lysis process.

b. Potassium chloride (KCl): Similar to NaCl, KCl can be used to adjust the ionic strength and facilitate cell lysis.

Enzymes:

Certain enzymes are added to lysing buffers to enhance cell lysis by digesting specific cellular components that can interfere with the extraction of the target enzyme.

Examples of enzymes used in lysing buffers include:

a. Lysozyme: Lysozyme breaks down the peptidoglycan layer of bacterial cell walls, weakening their structural integrity and facilitating subsequent disruption. It is particularly effective for Gram-positive bacteria.

b. DNasa (desoxirribonucleasa): La DNasa degrada el ADN presente en el lisado, reduciendo su viscosidad y evitando interferencias relacionadas con el ADN en los pasos de purificación posteriores.

c. RNasa (Ribonucleasa): Al igual que la DNasa, la RNasa degrada el ARN en el lisado, reduciendo su viscosidad y minimizando la interferencia relacionada con el ARN.

La combinación y las concentraciones específicas de detergentes, sales y enzimas en los tampones de lisis pueden variar según la enzima objetivo, el tipo de célula y los requisitos experimentales. La optimización de estos componentes es crucial para lograr una lisis celular eficiente, preservando al mismo tiempo la estabilidad y la actividad de la enzima deseada durante el proceso de purificación.

En estudios como la identificación genética mediante huellas dactilares, se utiliza un tampón de lisis para aislar el ADN. En caso de necesidad, se puede usar jabón líquido para romper las membranas celulares y nucleares, lo que permite liberar el ADN. Otros tampones de lisis similares incluyen el producto patentado de Qiagen, el Buffer P2.