PEGilación de lisozima

La cromatografía de intercambio iónico se emplea a menudo en el primer paso, o paso de captura, para la separación de proteínas PEGiladas, ya que la PEGilación puede afectar las cargas de las proteínas objetivo neutralizando la interacción electrostática , cambiando el punto isoeléctrico (pI) y aumentando el valor de pKa . ^{[ 2 ]} Debido al alto pI de la lisozima (pI = 10,7), se utiliza la cromatografía de intercambio catiónico. ^{[ 2 ] [ 9 ]} Como el mayor grado de PEGilación disminuye la fuerza iónica de la proteína, las proteínas poli-PEGiladas tienden a unirse a la resina catiónica más débilmente que la proteína mono-PEGilada o la forma intacta. Por lo tanto, las proteínas poli-PEGiladas eluyen más rápido y la proteína intacta eluye al final en la cromatografía de intercambio catiónico. ^{[ 10 ]} Como la mono-PEGilación se investiga ampliamente y se describe como una protección de las proteínas objetivo, el eluato objetivo en la cromatografía de intercambio catiónico suele ser las proteínas mono-PEGiladas. ^{[ 7 ]}

A pesar de la capacidad de la cromatografía de intercambio catiónico en el proceso de purificación, también se emplea la cromatografía de interacción hidrofóbica , generalmente en la segunda etapa como paso de pulido. Mediante el uso de resina catiónica de tamaño de perlas relativamente pequeño, la cromatografía de intercambio catiónico puede identificar y separar las isoformas según las cargas aparentes en la solución, mientras que la cromatografía de interacción hidrofóbica es capaz de identificar y separar las isoformas por su hidrofobicidad. ^{[ 11 ]}

Debido a las aparentes diferencias de tamaño según el grado de PEGilación de la proteína, se puede utilizar la cromatografía de exclusión por tamaño ( cromatografía líquida rápida de proteínas o FPLC). ^{[ 4 ] [ 5 ]} Existe una correlación negativa entre el peso molecular y el tiempo de retención de la proteína PEGilada en el cromatograma; las proteínas más grandes, o más PEGiladas, eluyen primero, y las más pequeñas, o intactas, eluyen más tarde. ^{[ 2 ]}

La actividad enzimática de la lisozima intacta y PEGilada se puede evaluar utilizando glicol quitosano , haciendo reaccionar 1 mL de glicol quitosano al 0,05 % (p/v) en tampón de acetato 100 mM a pH 5,5 y 100 μL de la proteína intacta o PEGilada a 40 °C durante 30 min y añadiendo posteriormente 2 mL de carbonato de sodio 0,5 M con 1 μg de ferricianuro de potasio . ^{[ 12 ]} La mezcla se calienta inmediatamente, se hierve durante 15 minutos y se enfría para el análisis espectral a 420 nm. ^{[ 12 ]} Como la actividad enzimática para hidrolizar el enlace β-1,4-N-acetilglucosamina se mantuvo después de la PEGilación, no hubo disminución de la actividad enzimática al aumentar el grado de PEGilación. ^{[ 4 ]}

Mediante la medición de la disminución de la turbidez de M. lysodeikticus al incubarlo con lisozima, se puede evaluar la actividad enzimática . ^{[ 13 ]} Se agregan 7,5 μL de proteínas de 0,1 - 1 mg/mL a 200 μL de M. lysodeikticus a su densidad óptica (DO) de 1,7 AU, y la mezcla se mide a 450 nm periódicamente para el cálculo de la velocidad de reacción. ^{[ 5 ] [ 13 ]} Por el contrario al resultado de la actividad enzimática del glicol quitosano, el grado creciente de PEGilación disminuyó la actividad enzimática. ^{[ 4 ] [ 5 ]} Esta diferencia en la tendencia de la actividad enzimática puede deberse a que la PEGilación a lisina libre causa impedimento estérico y posteriormente impide la formación del complejo enzima-sustrato en el caso de reaccionar con macromoléculas, como M. lysodeikticus. ^{[ 4 ] [ 5 ] [ 14 ]}