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Desorción/ionización láser asistida por matriz

Espectrómetro de masas MALDI TOF En espectrometría de masas , la desorción/ionización láser asistida por matriz ( MALDI ) es una técnica de ionización que utiliza una matriz abs...

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Espectrómetro de masas MALDI TOF

En espectrometría de masas , la desorción/ionización láser asistida por matriz ( MALDI ) es una técnica de ionización que utiliza una matriz absorbente de energía láser para crear iones a partir de moléculas grandes con una fragmentación mínima. [ 1 ] Se ha aplicado al análisis de biomoléculas ( biopolímeros como ADN , proteínas , péptidos y carbohidratos ) y diversas moléculas orgánicas (como polímeros , dendrímeros y otras macromoléculas ), que tienden a ser frágiles y se fragmentan cuando se ionizan mediante métodos de ionización más convencionales. Es similar a la ionización por electrospray (ESI) en el sentido de que ambas técnicas son métodos relativamente suaves (de baja fragmentación) para obtener iones de moléculas grandes en fase gaseosa, aunque MALDI generalmente produce muchos menos iones multicargados. [ 2 ]

La metodología MALDI es un proceso de tres pasos. Primero, la muestra se mezcla con un material de matriz adecuado y se aplica a una placa metálica. Segundo, un láser pulsado irradia la muestra, provocando la ablación y desorción de la muestra y del material de matriz. Finalmente, las moléculas del analito se ionizan mediante protonación o desprotonación en la columna caliente de gases ablacionados, y luego se pueden acelerar hacia el espectrómetro de masas que se utilice para analizarlas. [ 3 ]

Historia

El término ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI) fue acuñado en 1985 por Franz Hillenkamp , ​​Michael Karas y sus colegas. [ 4 ] Estos investigadores descubrieron que el aminoácido alanina podía ionizarse más fácilmente si se mezclaba con el aminoácido triptófano y se irradiaba con un  láser pulsado de 266 nm. El triptófano absorbía la energía del láser y ayudaba a ionizar la alanina, que no la absorbía. Péptidos de hasta 2843 Da , como la melitina, podían ionizarse al mezclarse con este tipo de "matriz". [ 5 ] El avance decisivo para la ionización por desorción láser de moléculas grandes se produjo en 1987, cuando Koichi Tanaka, de Shimadzu Corporation, y sus colaboradores utilizaron lo que denominaron el "método de matriz líquida con metal ultrafino", que combinaba partículas de cobalto  de 30 nm en glicerol con un láser de nitrógeno de 337 nm para la ionización. [ 6 ] Utilizando esta combinación de láser y matriz, Tanaka pudo ionizar biomoléculas tan grandes como la proteína carboxipeptidasa-A de 34 472 Da. Tanaka recibió una cuarta parte del Premio Nobel de Química de 2002 por demostrar que, con la combinación adecuada de longitud de onda del láser y matriz, una proteína puede ser ionizada. [ 7 ] Posteriormente, Karas y Hillenkamp pudieron ionizar la proteína albúmina de 67 kDa utilizando una matriz de ácido nicotínico y un láser de 266 nm. [ 8 ] Se lograron mejoras adicionales mediante el uso de un láser de 355 nm y los derivados del ácido cinámico ácido ferúlico , ácido cafeico y ácido sinapínico como matriz. [ 9 ] La disponibilidad de láseres de nitrógeno pequeños y relativamente económicos que operan a una longitud de onda de 337 nm y los primeros instrumentos comerciales introducidos a principios de la década de 1990 llevaron MALDI a un número creciente de investigadores. [ 10 ] Hoy en día, se utilizan principalmente matrices orgánicas para la espectrometría de masas MALDI.    

Matriz

La matriz consiste en moléculas cristalizadas , de las cuales las tres más utilizadas son el ácido sinapínico , el ácido α-ciano-4-hidroxicinámico (α-CHCA, alfa-ciano o alfa-matriz) y el ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB). [ 16 ] Se prepara una solución de una de estas moléculas, a menudo en una mezcla de agua altamente purificada y un disolvente orgánico como el acetonitrilo (ACN) o el etanol. Generalmente se añade una fuente de contraiones como el ácido trifluoroacético (TFA) para generar los iones [M+H]. Un buen ejemplo de una solución de matriz sería 20  mg/mL de ácido sinapínico en ACN:agua:TFA (50:50:0,1).

Notación para las sustituciones del ácido cinámico

La identificación de compuestos de matriz adecuados se determina en cierta medida por ensayo y error, pero se basan en algunas consideraciones específicas de diseño molecular. Tienen un peso molecular bastante bajo (para permitir una fácil vaporización), pero son lo suficientemente grandes (con una presión de vapor suficientemente baja) como para no evaporarse durante la preparación de la muestra o mientras están en el espectrómetro de masas. Suelen ser ácidos, por lo que actúan como una fuente de protones para fomentar la ionización del analito. También se han descrito matrices básicas. [ 17 ] Tienen una fuerte absorción óptica en el rango UV o IR, [ 18 ] de modo que absorben rápida y eficientemente la irradiación láser. Esta eficiencia se asocia comúnmente con estructuras químicas que incorporan varios enlaces dobles conjugados , como se ve en la estructura del ácido cinámico . Están funcionalizados con grupos polares, lo que permite su uso en soluciones acuosas. Normalmente contienen un cromóforo .

La solución matriz se mezcla con el analito (por ejemplo, una muestra de proteína ). Una mezcla de agua y disolvente orgánico permite que tanto las moléculas hidrofóbicas como las hidrosolubles ( hidrofílicas ) se disuelvan en la solución. Esta solución se deposita sobre una placa MALDI (generalmente una placa metálica diseñada para este fin). Los disolventes se vaporizan, dejando únicamente la matriz recristalizada, pero ahora con moléculas de analito incrustadas en los cristales MALDI. Se dice que la matriz y el analito están cocristalizados. La cocristalización es fundamental para seleccionar una matriz adecuada que permita obtener un espectro de masas de buena calidad del analito de interés.

En el análisis de sistemas biológicos, las sales inorgánicas, que también forman parte de los extractos de proteínas, interfieren con el proceso de ionización. Estas sales pueden eliminarse mediante extracción en fase sólida o lavando las gotas secas de MALDI con agua fría. [ 19 ] Ambos métodos también pueden eliminar otras sustancias de la muestra. La mezcla matriz-proteína no es homogénea debido a que la diferencia de polaridad provoca la separación de las dos sustancias durante la cocristalización. El diámetro del punto de la muestra es mucho mayor que el del láser, lo que hace necesario realizar múltiples disparos láser en diferentes puntos de la muestra para obtener el promedio estadístico de la concentración de la sustancia dentro del punto de la muestra.

El naftaleno y los compuestos similares al naftaleno también pueden utilizarse como matriz para ionizar una muestra.

La matriz se puede utilizar para ajustar el instrumento y ionizar la muestra de diferentes maneras. Como se mencionó anteriormente, las reacciones ácido-base se utilizan a menudo para ionizar la muestra; sin embargo, las moléculas con sistemas pi conjugados , como los compuestos tipo naftaleno, también pueden servir como aceptores de electrones y, por lo tanto, como matriz para MALDI/TOF. [ 20 ] Esto es particularmente útil para estudiar moléculas que también poseen sistemas pi conjugados. [ 21 ] La aplicación más utilizada para estas matrices es el estudio de compuestos tipo porfirina , como la clorofila . Se ha demostrado que estas matrices tienen mejores patrones de ionización que no dan como resultado patrones de fragmentación extraños ni la pérdida completa de cadenas laterales. [ 22 ] También se ha sugerido que las moléculas tipo porfirina conjugadas pueden servir como matriz y escindirse a sí mismas, eliminando la necesidad de un compuesto de matriz separado. [ 23 ]

Instrumentación

Diagrama de un instrumento MALDI TOF. La matriz de la muestra, ionizada por energía radiante, es expulsada de la superficie. La muestra se desplaza hacia el analizador de masas, donde se detecta en gran medida.

Existen varias variantes de la tecnología MALDI y actualmente se producen instrumentos comparables para propósitos muy diferentes, desde más académicos y analíticos hasta más industriales y de alto rendimiento. El campo de la espectrometría de masas se ha expandido hasta requerir espectrometría de masas de ultra alta resolución como los instrumentos FT-ICR [ 24 ] [ 25 ] así como instrumentos de mayor rendimiento. [ 26 ] Dado que muchos instrumentos MALDI MS se pueden comprar con una fuente de ionización intercambiable ( ionización por electrospray , MALDI, ionización a presión atmosférica , etc.), las tecnologías a menudo se superponen y muchas veces se podría utilizar cualquier método de ionización suave. Para más variantes de métodos de ionización suave, consulte: Desorción láser suave o Fuente de iones .

Láser

Las técnicas MALDI suelen emplear láseres UV como los láseres de nitrógeno (337 nm) y los láseres Nd:YAG  de frecuencia triplicada y cuadruplicada (355 nm y 266 nm respectivamente). [ 27 ]  

Las longitudes de onda de láser infrarrojo utilizadas para MALDI infrarrojo incluyen el láser Er:YAG  de 2,94 μm , el oscilador paramétrico óptico de infrarrojo medio y el láser de dióxido de carbono de 10,6 μm . Aunque no son tan comunes, los láseres infrarrojos se utilizan debido a su modo de ionización más suave. [ 28 ] IR-MALDI también tiene la ventaja de una mayor eliminación de material (útil para muestras biológicas), menor interferencia de masa baja y compatibilidad con otros métodos de espectrometría de masas por desorción láser sin matriz. 

Hora del vuelo

Objetivo de muestra para un espectrómetro de masas MALDI

El tipo de espectrómetro de masas más utilizado con MALDI es el espectrómetro de masas de tiempo de vuelo (TOF), principalmente debido a su amplio rango de masas. El procedimiento de medición TOF también se adapta idealmente al proceso de ionización MALDI, ya que el láser pulsado toma "disparos" individuales en lugar de funcionar de forma continua. Los instrumentos MALDI-TOF suelen estar equipados con un reflectrón (un "espejo iónico") que refleja los iones mediante un campo eléctrico. Esto aumenta la trayectoria de vuelo de los iones, incrementando así el tiempo de vuelo entre iones de diferente m/z y mejorando la resolución. Los modernos instrumentos TOF con reflectrón comerciales alcanzan un poder de resolución m/Δm de 50 000 FWHM (ancho completo a media altura, Δm definido como el ancho del pico al 50 % de la altura del pico) o más. [ 29 ]

MALDI se ha acoplado con IMS -TOF MS para identificar péptidos fosforilados y no fosforilados. [ 30 ] [ 31 ]

Se ha demostrado que la espectrometría de masas MALDI- FT-ICR es una técnica útil cuando se desean mediciones de MALDI-MS de alta resolución. [ 32 ]

Presión atmosférica

La desorción/ionización láser asistida por matriz a presión atmosférica (MALDI-AP) es una técnica de ionización (fuente de iones) que, a diferencia de la MALDI al vacío, opera en un entorno atmosférico normal. [ 33 ] La principal diferencia entre la MALDI al vacío y la AP-MALDI es la presión a la que se crean los iones. En la MALDI al vacío, los iones se producen típicamente a 10 mTorr o menos, mientras que en la AP-MALDI los iones se forman a presión atmosférica. En el pasado, la principal desventaja de la técnica AP-MALDI en comparación con la MALDI al vacío convencional ha sido su sensibilidad limitada; sin embargo, los iones se pueden transferir al espectrómetro de masas con alta eficiencia y se han reportado límites de detección de attomoles. [ 34 ] La AP-MALDI se utiliza en espectrometría de masas (EM) en una variedad de aplicaciones que van desde la proteómica hasta el descubrimiento de fármacos. Los temas populares que se abordan mediante la espectrometría de masas AP-MALDI incluyen: proteómica; Análisis de masas de ADN, ARN, PNA, lípidos, oligosacáridos, fosfopéptidos, bacterias, moléculas pequeñas y polímeros sintéticos, aplicaciones similares a las disponibles también para instrumentos MALDI de vacío. La fuente de iones AP-MALDI se acopla fácilmente a un espectrómetro de masas de trampa de iones [ 35 ] o a cualquier otro sistema de espectrometría de masas equipado con ionización por electrospray (ESI) o fuente nanoESI.

Se sabe que la MALDI con ionización a presión reducida produce principalmente iones con carga simple (véase «Mecanismo de ionización» más adelante). En cambio, la ionización a presión atmosférica puede generar analitos con carga elevada, como se demostró inicialmente para los láseres infrarrojos [ 36 ] y posteriormente también para los láseres de nitrógeno [ 37 ] . La carga múltiple de los analitos es de gran importancia, ya que permite medir compuestos de alto peso molecular, como las proteínas, en instrumentos que solo ofrecen rangos de detección m/z más pequeños , como los cuadrupolos. Además de la presión, la composición de la matriz es importante para lograr este efecto.

Aerosol

En la espectrometría de masas de aerosoles , una de las técnicas de ionización consiste en disparar un láser a gotas individuales. Estos sistemas se denominan espectrómetros de masas de partículas individuales (SPMS) . [ 38 ] Opcionalmente, la muestra puede mezclarse con una matriz MALDI antes de la aerosolización.

Mecanismo de ionización

El láser se dispara hacia los cristales de la matriz en el punto de la gota seca. La matriz absorbe la energía del láser y se cree que, principalmente, la matriz se desorbe e ioniza (por adición de un protón ) durante este evento. La pluma caliente producida durante la ablación contiene muchas especies: moléculas de matriz neutras e ionizadas, moléculas de matriz protonadas y desprotonadas, cúmulos de matriz y nanogotas . Las especies ablacionadas pueden participar en la ionización del analito, aunque el mecanismo de MALDI aún se debate. Se cree entonces que la matriz transfiere protones a las moléculas del analito (por ejemplo, moléculas de proteína), cargando así el analito. [ 39 ] Un ion observado después de este proceso consistirá en la molécula neutra inicial [M] con iones añadidos o eliminados. Esto se denomina ion cuasimolecular, por ejemplo, [M+H] + en el caso de un protón añadido, [M+Na] + en el caso de un ion sodio añadido , o [MH] − en el caso de un protón eliminado. MALDI es capaz de generar iones con carga simple o múltiple ([M+nH] n+ ) dependiendo de la naturaleza de la matriz, la intensidad del láser y/o el voltaje utilizado. Cabe destacar que todas estas son especies con número par de electrones. Se pueden observar señales iónicas de cationes radicales (moléculas fotoionizadas), por ejemplo, en el caso de moléculas de la matriz y otras moléculas orgánicas.

El modelo de transferencia de protones en fase gaseosa, [ 3 ] implementado como el modelo de dinámica física y química acoplada (CPCD), [ 40 ] de MALDI láser UV postula procesos primarios y secundarios que conducen a la ionización. [ 41 ] Los procesos primarios implican la separación inicial de carga a través de la absorción de fotones por la matriz y la acumulación de la energía para formar pares de iones de la matriz. La formación de iones primarios ocurre a través de la absorción de un fotón UV para crear moléculas en estado excitado por

S 0 + hν → S 1
S 1 + S 1 → S 0 + S n
S 1 + S n → M + + M −

donde S 0 es el estado electrónico fundamental, S 1 el primer estado electrónico excitado y S n es un estado electrónico excitado superior. [ 40 ] Los iones producto pueden ser pares iónicos de transferencia de protones o de electrones, indicados por M + y M − arriba. Los procesos secundarios implican reacciones ión-molécula para formar iones analito.

En el modelo del superviviente afortunado, los iones positivos pueden formarse a partir de cúmulos altamente cargados producidos durante la ruptura del sólido que contiene la matriz y el analito.

El modelo del superviviente afortunado (mecanismo de ionización de cúmulos [ 3 ] ) postula que las moléculas del analito se incorporan a la matriz manteniendo el estado de carga de la solución. [ 42 ] [ 43 ] La formación de iones ocurre a través de la separación de carga tras la fragmentación de cúmulos ablacionados por láser. [ 3 ] Los iones que no se neutralizan por recombinación con fotoelectrones o contraiones son los llamados supervivientes afortunados.

El modelo térmico postula que la alta temperatura facilita la transferencia de protones entre la matriz y el analito en el líquido de la matriz fundida. [ 44 ] La relación ión-neutro es un parámetro importante para justificar el modelo teórico, y la cita errónea de la relación ión-neutro podría resultar en una determinación errónea del mecanismo de ionización. [ 45 ] El modelo predice cuantitativamente el aumento en la intensidad iónica total como función de la concentración y la afinidad protónica de los analitos, y la relación ión-neutro como función de las fluencias del láser . [ 46 ] [ 47 ] Este modelo también sugiere que los aductos de iones metálicos (por ejemplo, [M+Na] + o [M+K] + ) se generan principalmente a partir de la disolución de sal inducida térmicamente. [ 48 ]

El método de ionización asistida por matriz (MAI) utiliza una preparación de matriz similar a la de MALDI, pero no requiere ablación láser para producir iones de analito de compuestos volátiles o no volátiles. [ 49 ] Simplemente exponiendo la matriz con el analito al vacío del espectrómetro de masas se crean iones con estados de carga casi idénticos a los de la ionización por electrospray. [ 50 ] Se sugiere que probablemente existan similitudes mecanísticas entre este proceso y MALDI. [ 43 ]

El rendimiento de iones se estima típicamente en un rango de 10 −4 a 10 −7 , [ 51 ] con algunos experimentos que sugieren rendimientos aún más bajos de 10 −9 . [ 52 ] El problema de los bajos rendimientos de iones se había abordado, ya poco después de la introducción de MALDI mediante varios intentos, incluida la postionización utilizando un segundo láser. [ 53 ] La mayoría de estos intentos mostraron solo un éxito limitado, con bajos aumentos de señal. Esto podría atribuirse al hecho de que se utilizaron instrumentos axiales de tiempo de vuelo, que operan a presiones en la región de la fuente de 10 −5 a 10 −6 , lo que resulta en una rápida expansión de la pluma con velocidades de partículas de hasta 1000  m/s. [ 54 ] En 2015, se informó de una postionización láser exitosa, utilizando una fuente MALDI modificada operada a una presión elevada de ~3 mbar acoplada a un analizador de masas de tiempo de vuelo ortogonal, y empleando un láser de postionización de longitud de onda sintonizable, operado a una longitud de onda de 260  nm a 280  nm, por debajo del umbral de ionización de dos fotones de las matrices utilizadas, lo que elevó los rendimientos iónicos de varios lípidos y moléculas pequeñas hasta en tres órdenes de magnitud. [ 55 ] Este enfoque, llamado MALDI-2, debido al segundo láser y al segundo proceso de ionización tipo MALDI, fue adoptado posteriormente para otros espectrómetros de masas, todos equipados con fuentes que operan en el rango de bajo mbar. [ 56 ] [ 57 ]

Aplicaciones

Bioquímica

En proteómica , MALDI se utiliza para la identificación rápida de proteínas aisladas mediante electroforesis en gel : SDS-PAGE , cromatografía de exclusión por tamaño , cromatografía de afinidad , intercambio iónico fuerte/débil, marcaje de proteínas con isótopos (ICPL) y electroforesis bidimensional en gel . La huella peptídica es la aplicación analítica más popular de los espectrómetros de masas MALDI-TOF. Los espectrómetros de masas MALDI TOF/TOF se utilizan para revelar la secuencia de aminoácidos de los péptidos mediante decaimiento posterior a la fuente o disociación inducida por colisión de alta energía (para más información, véase espectrometría de masas ).

MALDI-TOF se ha utilizado para caracterizar modificaciones postraduccionales . Por ejemplo, se ha aplicado ampliamente para estudiar la metilación y desmetilación de proteínas . [ 58 ] [ 59 ] Sin embargo, se debe tener cuidado al estudiar modificaciones postraduccionales mediante MALDI-TOF. Por ejemplo, se ha informado que se ha identificado la pérdida de ácido siálico en artículos cuando se ha utilizado ácido dihidroxibenzoico (DHB) como matriz para el análisis MALDI MS de péptidos glicosilados. Utilizando ácido sinapínico, 4-HCCA y DHB como matrices, S. Martin estudió la pérdida de ácido siálico en péptidos glicosilados por descomposición metaestable en MALDI/TOF en modo lineal y modo reflector. [ 60 ] Un grupo de Shimadzu Corporation derivatizó el ácido siálico mediante una reacción de amidación como una forma de mejorar la sensibilidad de detección [ 61 ] y también demostró que la matriz de líquido iónico reduce la pérdida de ácido siálico durante el análisis MALDI/TOF MS de oligosacáridos sialilados. [ 62 ] THAP, [ 63 ] DHAP, [ 64 ] y una mezcla de 2-aza-2-tiotimina y fenilhidrazina [ 65 ] se han identificado como matrices que podrían usarse para minimizar la pérdida de ácido siálico durante el análisis MALDI MS de péptidos glicosilados. Se ha informado que se puede lograr una reducción en la pérdida de algunas modificaciones postraduccionales si se usa IR MALDI en lugar de UV MALDI. [ 66 ]

Además de las proteínas, MALDI-TOF también se ha aplicado para estudiar lípidos . [ 67 ] Por ejemplo, se ha aplicado para estudiar las reacciones catalíticas de las fosfolipasas . [ 68 ] [ 69 ] Además de los lípidos, los oligonucleótidos también se han caracterizado mediante MALDI-TOF. Por ejemplo, en biología molecular, una mezcla de ácido 5-metoxisalicílico y espermina puede utilizarse como matriz para el análisis de oligonucleótidos en espectrometría de masas MALDI, [ 70 ] por ejemplo, después de la síntesis de oligonucleótidos .

Química orgánica

Algunas macromoléculas sintéticas, como los catenanos y rotaxanos , los dendrímeros y los polímeros hiperramificados , y otros ensamblajes, tienen pesos moleculares que se extienden a miles o decenas de miles, donde la mayoría de las técnicas de ionización tienen dificultades para producir iones moleculares. MALDI es un método analítico simple y rápido que permite a los químicos analizar rápidamente los resultados de dichas síntesis y verificarlos. [ 71 ]

Polímeros

En química de polímeros, MALDI se puede utilizar para determinar la distribución de masa molar . [ 72 ] Los polímeros con una polidispersidad mayor que 1,2 son difíciles de caracterizar con MALDI debido a la discriminación de la intensidad de la señal frente a los oligómeros de mayor masa. [ 73 ] [ 74 ] [ 75 ]

Una buena matriz para polímeros es el ditranol [ 76 ] o el AgTFA . [ 77 ] La ​​muestra debe mezclarse primero con ditranol y luego agregar el AgTFA; de lo contrario, la muestra precipitará de la solución.

Microbiología

Ejemplo de algoritmo de diagnóstico para una posible infección bacteriana en casos sin objetivos específicos (agentes no bacterianos, micobacterias, etc.), con las situaciones y agentes más comunes observados en un hospital comunitario de Nueva Inglaterra. La técnica MALDI-TOF se muestra en varias situaciones en la fila de "pruebas del mismo día" en la parte inferior central.

Los espectros MALDI-TOF se utilizan a menudo para la identificación de microorganismos como bacterias u hongos. Una porción de una colonia del microbio en cuestión se coloca sobre la muestra objetivo y se cubre con una matriz. Los espectros de masas de las proteínas expresadas generadas se analizan mediante un software específico y se comparan con perfiles almacenados para la determinación de especies en lo que se conoce como biotipificación. Ofrece ventajas respecto a otros procedimientos inmunológicos o bioquímicos y se ha convertido en un método común para la identificación de especies en laboratorios de microbiología clínica. [ 78 ] [ 79 ] Se han demostrado las ventajas de la espectrometría de masas MALDI de alta resolución realizada en una espectrometría de masas de resonancia ciclotrónica de iones por transformada de Fourier (también conocida como FT-MS) para la tipificación y subtipificación de virus mediante la detección de iones individuales conocida como proteotipado, con especial atención a los virus de la gripe. [ 80 ]

Una de las principales ventajas sobre otros métodos de identificación microbiológica es su capacidad para identificar de forma rápida y fiable, a bajo coste, una amplia variedad de microorganismos directamente a partir del medio selectivo utilizado para aislarlos. La ausencia de la necesidad de purificar la colonia sospechosa o "presuntiva" [ 81 ] permite tiempos de respuesta mucho más rápidos. Por ejemplo, se ha demostrado que MALDI-TOF puede utilizarse para detectar bacterias directamente en hemocultivos. [ 82 ]

Otra ventaja es el potencial para predecir la susceptibilidad de las bacterias a los antibióticos. Un único pico en el espectro de masas puede predecir la resistencia a la meticilina de Staphylococcus aureus . [ 83 ] MALDI también puede detectar carbapenemasas de enterobacterias resistentes a los carbapenémicos , [ 84 ] incluyendo Acinetobacter baumannii [ 85 ] y Klebsiella pneumoniae . [ 86 ] Sin embargo, la mayoría de las proteínas que median la resistencia a los antibióticos son más grandes que el rango de 2000–20 000 Da de MALDI-TOF para la interpretación de picos de proteínas y solo ocasionalmente, como en el brote de carbapenemasa de Klebsiella pneumoniae (KPC) de 2011 en los NIH, se puede establecer una correlación entre un pico y una proteína que confiere resistencia. [ 87 ]

Parasitología

Los espectros MALDI-TOF se han utilizado para la detección e identificación de varios parásitos como tripanosomátidos , [ 88 ] Leishmania [ 89 ] y Plasmodium . [ 90 ] Además de estos parásitos unicelulares , MALDI/TOF se puede utilizar para la identificación de insectos parásitos como piojos [ 91 ] o cercarias , la fase de vida libre de los trematodos . [ 92 ]

Medicamento

Los espectros MALDI-TOF se utilizan frecuentemente junto con otras técnicas de análisis y espectroscopia en el diagnóstico de enfermedades. MALDI/TOF es una herramienta de diagnóstico con gran potencial, ya que permite la identificación rápida de proteínas y sus alteraciones sin el coste ni la potencia computacional de la secuenciación , ni la habilidad ni el tiempo necesarios para resolver una estructura cristalina mediante cristalografía de rayos X.

Un ejemplo de esto es la enterocolitis necrotizante (ECN), una enfermedad devastadora que afecta el intestino de los bebés prematuros. Los síntomas de la ECN son muy similares a los de la sepsis , y muchos bebés fallecen mientras esperan un diagnóstico y tratamiento. Se utilizó MALDI/TOF para identificar las bacterias presentes en las heces de bebés con ECN. Este estudio se centró en la caracterización de la microbiota fecal asociada a la ECN y no abordó el mecanismo de la enfermedad. Existe la esperanza de que una técnica similar pueda utilizarse como herramienta de diagnóstico rápido que no requiera secuenciación. [ 93 ]

Otro ejemplo del poder diagnóstico de MALDI/TOF se encuentra en el área del cáncer . El cáncer de páncreas sigue siendo uno de los cánceres más mortales y difíciles de diagnosticar. [ 94 ] Se sospecha desde hace tiempo que la alteración de la señalización celular debido a mutaciones en proteínas de membrana contribuye al cáncer de páncreas. [ 95 ] MALDI/TOF se ha utilizado para identificar una proteína de membrana asociada con el cáncer de páncreas y, en algún momento, incluso podría servir como técnica de detección temprana. [ 96 ]

MALDI/TOF también puede utilizarse para guiar el tratamiento y el diagnóstico. Este método permite determinar la resistencia bacteriana a los antibióticos, especialmente a los betalactámicos (familia de la penicilina). MALDI/TOF detecta la presencia de carbapenemasas, lo que indica resistencia a los antibióticos convencionales. Se prevé que este método permita identificar una bacteria resistente a los antibióticos en tan solo tres horas. Esta técnica podría ayudar a los médicos a decidir si prescribir antibióticos más agresivos inicialmente. [ 97 ]

Detección de complejos proteicos

Tras las observaciones iniciales de que algunos complejos péptido-péptido podían sobrevivir a la deposición e ionización MALDI, [ 98 ] se han publicado estudios de grandes complejos proteicos utilizando MALDI-MS. [ 99 ] [ 100 ]

Moléculas pequeñas

Si bien MALDI es una técnica común para macromoléculas grandes, a menudo también es posible analizar moléculas pequeñas con una masa inferior a 1000 Da. El problema con las moléculas pequeñas radica en los efectos de matriz, donde es posible la interferencia de la señal, la saturación del detector o la supresión de la señal del analito, ya que las matrices suelen estar compuestas por las propias moléculas pequeñas. La elección de la matriz depende en gran medida de las moléculas que se van a analizar. [ 101 ] [ 102 ]

Espectrometría de masas por imagen MALDI

Debido a que MALDI es una fuente de ionización suave, se utiliza en una amplia variedad de biomoléculas. Esto ha propiciado su uso en nuevas aplicaciones, como la espectrometría de masas por imagen MALDI. Esta técnica permite visualizar la distribución espacial de las biomoléculas. [ 103 ]

Véase también

Referencias

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  2. ↑ Hosseini, Samira (2017). "Fundamentos del análisis MALDI-ToF-MS" . Springer Singapore . SpringerBriefs in Applied Sciences and Technology. doi : 10.1007/978-981-10-2356-9 . ISBN 978-981-10-2355-2.
  3. 1 2 3 4 Karas, Michael; Krüger, Ralf (2003). "Formación de iones en MALDI: el mecanismo de ionización de clústeres". Chemical Reviews . 103 (2): 427– 440. Bibcode : 2003ChRv..103..427K . doi : 10.1021/cr010376a . ISSN 0009-2665 . PMID 12580637 .  
  4. ↑ Karas, M.; Bachmann, D.; Hillenkamp, ​​F. (1985). "Influencia de la longitud de onda en la espectrometría de masas por desorción láser ultravioleta de alta irradiancia de moléculas orgánicas". Analytical Chemistry . 57 (14): 2935– 9. Bibcode : 1985AnaCh..57.2935K . doi : 10.1021/ac00291a042 .
  5. ↑ Karas, M.; Bachmann, D.; Bahr, U.; Hillenkamp, ​​F. (1987). "Desorción láser ultravioleta asistida por matriz de compuestos no volátiles". International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes . 78 : 53–68 . Bibcode : 1987IJMSI..78...53K . doi : 10.1016/0168-1176(87)87041-6 .
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  7. ↑ Markides, K.; Gräslund, A. (9 de octubre de 2002). "Información anticipada sobre el Premio Nobel de Química 2002" (PDF) . Real Academia Sueca de Ciencias . págs. 1–13 . Recuperado el 28 de agosto de 2013 . 
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