mCherry

mCherry es un miembro de la familia mFruits de proteínas fluorescentes rojas monoméricas (mRFP). Como RFP, mCherry se derivó de DsRed de las anémonas de mar Discosoma , a diferencia de las proteínas fluorescentes verdes (GFP), que a menudo se derivan de la medusa Aequorea victoria . ^{[ 1 ]} Las proteínas fluorescentes se utilizan para marcar componentes en las células para que puedan estudiarse mediante espectroscopia de fluorescencia y microscopía de fluorescencia . mCherry absorbe luz entre 540 y 590 nm y emite luz en el rango de 550-650 nm. ^{[ 2 ]} mCherry pertenece al grupo de cromóforos de proteínas fluorescentes utilizados como instrumentos para visualizar genes y analizar sus funciones en experimentos. La edición del genoma ha mejorado enormemente mediante la inserción precisa de estas etiquetas de proteínas fluorescentes en el material genético de muchos organismos diversos. La mayoría de las comparaciones entre el brillo y la fotoestabilidad de diferentes proteínas fluorescentes se han realizado in vitro , eliminando las variables biológicas que afectan el rendimiento de las proteínas en células u organismos. ^{[ 3 ]} Es difícil simular perfectamente los entornos celulares in vitro, y la diferencia en el entorno podría tener un efecto en el brillo y la fotoestabilidad.  

Las mRFP, como la mCherry, son útiles porque tienen un peso molecular menor y se pliegan más rápido que los tetrámeros , lo que reduce la alteración del sistema objetivo.

DsRed se aísla de las anémonas de mar Discosoma y es una proteína tetramérica . ^{[ 1 ]} La mayoría de las proteínas fluorescentes rojas provienen de DsRed. DsRed tiene baja fotoestabilidad (resistencia al cambio bajo la influencia de la luz) y una tasa de maduración lenta (tiempo hasta que la mitad de la proteína se pliega). mRFP1 se deriva de DsRed y es un monómero por lo que es más pequeño, pero su rendimiento cuántico y fotoestabilidad son menores que los de DsRed. ^{[ 1 ]} mCherry y otros mFruits tienen brillo y fotoestabilidad mejorados en comparación con DsRed y mRFP1. mCherry fue desarrollado mediante evolución dirigida a partir de mRFP1 por el grupo de Roger Tsien en UCSD. ^{[ 1 ]} Los mFruits en general se desarrollaron porque, si bien se podían encontrar proteínas de diferentes colores en otros antozoos , las proteínas serían en su mayoría tetrámeros, que probablemente tendrían los mismos problemas que DsRed. Estos tetrámeros requerirían derivaciones como las realizadas a DsRed para convertirlos en socios de fusión útiles. ^{[ 1 ]} Como resultado, los mFruits se derivaron de mRFP1 ajustando aminoácidos clave para modificar las longitudes de onda de excitación y emisión. Los diferentes colores permiten el seguimiento de distintos tipos de células, la actividad transcripcional y la fusión de proteínas. De entre todos los monómeros desarrollados, mCherry presenta las longitudes de onda más largas, la mayor fotoestabilidad, la maduración más rápida, una excelente resistencia al pH y es el más cercano a mRFP1 en sus máximos de excitación y emisión. ^{[ 1 ]} Sin embargo, mCherry tiene un rendimiento cuántico menor que mRFP1. ^{[ 1 ]}

El gen de mCherry tiene 711 pb de longitud, ^{[ 4 ]} y la proteína está compuesta por 236 residuos con una masa de 26,722 kDa . ^{[ 5 ]} La estructura cristalina de mCherry se determinó en 2006. ^{[ 6 ]} Contiene 3 hélices alfa y 13 láminas beta que forman el barril beta . El cromóforo de mCherry está compuesto por tres aminoácidos, metionina , tirosina y glicina , que se modifican postraduccionalmente en una imidazolinona . ^{[ 1 ]} El número de estos residuos en la secuencia es 71, 72 y 73, respectivamente. La conjugación extendida de electrones pi le da a mCherry su absorbancia y emisión desplazadas hacia el rojo. ^{[ 7 ]} El cromóforo se forma a partir de una hélice central que está protegida del disolvente en un barril beta de 11 hebras. ^{[ 7 ]} Esta estructura es casi idéntica a la estructura terciaria de DsRed, que también tiene un barril beta de 11 hebras, y es similar a la estructura terciaria de GFP. ^{[ 8 ]} Esto hace que el entorno alrededor del cromóforo en mCherry sea más hidrofóbico que el entorno alrededor del cromóforo de DsRed. ^{[ 9 ]} Los extremos terminales de mCherry son similares a los de GFP, lo que permite su incorporación en sistemas donde se puede usar GFP y mRFP1 no se podría haber usado. ^{[ 1 ]}

mCherry se utiliza en microscopía de fluorescencia como sonda intracelular. ^{[ 10 ]} Sin embargo, cuando una proteína se marca mediante fusión a una proteína fluorescente, las interacciones entre ellas pueden perturbar de forma indeseable su localización o función. ^{[ 11 ]}

mCherry es valioso cuando se desea la expresión génica constitutiva y otros enfoques experimentales requieren el control coordinado de múltiples genes. Si bien se han desarrollado múltiples métodos para su uso en E. coli y otros modelos, la utilidad y funcionalidad de dichas técnicas no siempre se traduce a otras especies. Por ejemplo, para el patógeno Gram-negativo Legionella pneumophila , vector de la enfermedad del legionario , el sistema P tac representa el único sistema de control de expresión bien establecido. Con el fin de mejorar las herramientas disponibles para estudiar la expresión génica bacteriana en L. pneumophila , se desarrolló mCherry, que confiere expresión génica constitutiva a partir de un sitio de unión LacI mutagenizado . mCherry no interfiere con otros plásmidos que contienen un sistema de expresión LacI-P tac intacto ni altera el crecimiento de las especies de Legionella durante el crecimiento intracelular. La estructura plasmídica de amplio rango de hospedadores de mCherry permitió la expresión génica constitutiva en una amplia variedad de especies bacterianas Gram-negativas, lo que convierte a mCherry en una herramienta útil para la comunidad científica en general. ^{[ 12 ]}

Puede utilizarse para marcar bacterias y visualizarlas sin la presión de los antibióticos ^{[ 13 ]} y también como aceptor y sonda de transferencia de energía resonante por fluorescencia (FRET) heterogénea de longitud de onda larga para experimentos de FRET homogénea ^{[ 14 ]} . La FRET es un tipo de transferencia de energía por fluorescencia en la que no hay fotones intermedios y la energía se transfiere del donante al aceptor.

Solicitud de propuestas original: DsRed

Solicitud de propuestas de primera generación: mRFP1

Solicitudes de propuestas de segunda generación: mStrawberry, mOrange, dTomato

Las mFruits son proteínas fluorescentes rojas monoméricas (mRFP) de segunda generación que presentan un brillo y una fotoestabilidad mejorados en comparación con la mRFP1 de primera generación. Sus longitudes de onda de emisión y excitación se distribuyen en un rango de aproximadamente 550-650 y 540-590  nm, respectivamente. Sin embargo, las variaciones en sus espectros pueden atribuirse a unos pocos aminoácidos clave. Los análisis espectroscópicos y cristalográficos de resolución atómica de tres representantes, mOrange, mStrawberry y mCherry, revelan que operan diferentes mecanismos para establecer los máximos de excitación y emisión. Al someterse a una segunda etapa de oxidación, cada mFruit produce un enlace acilimina en la cadena principal del polipéptido. En comparación con el progenitor DsRed, la modificación covalente directa de este enlace (mOrange) y la modificación indirecta del entorno del cromóforo (mStrawberry y mCherry) producen variantes con un fuerte desplazamiento hacia el azul y el rojo. El desplazamiento hacia el azul de mOrange es inducido por una modificación covalente de su estructura proteica.

El mapa de densidad electrónica indica la formación de un tercer heterociclo , 2-hidroxi-dihidrooxazol, tras la reacción de Thr 66 Oγ con la cadena principal del polipéptido, lo que a su vez reduce la conjugación del carbonilo en la posición 65 con el resto del cromóforo. En mStrawberry y mCherry, se propone que el movimiento de Lys 70 cargado y la protonación de Glu 215 modifican la distribución de densidad electrónica del cromóforo, induciendo su característico desplazamiento al rojo. ^{[ 2 ]}

• mCherry en FPbase, una base de datos de proteínas fluorescentes.