Visualización de ARNm

La técnica de visualización de ARNm se utiliza para la evolución in vitro de proteínas y/o péptidos , con el fin de crear moléculas capaces de unirse a una diana específica. Este proceso genera péptidos o proteínas traducidos que se asocian a su ARNm precursor mediante un enlace de puromicina . El complejo se une a la diana inmovilizada en una etapa de selección ( cromatografía de afinidad ). Las fusiones de ARNm-proteína que se unen eficazmente se transcriben inversamente a ADNc y su secuencia se amplifica mediante reacción en cadena de la polimerasa . El resultado es una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido con alta afinidad por la molécula de interés.

La puromicina es un análogo del extremo 3' del ARNt-tirosilado, cuya estructura se asemeja en parte a la de la adenosina y en parte a la de la tirosina . A diferencia del enlace éster escindible del ARNt-tirosilado, la puromicina posee un enlace amida no hidrolizable. Por consiguiente, la puromicina interfiere con la traducción y provoca la liberación prematura de los productos de la misma.

Todas las plantillas de ARNm utilizadas en la tecnología de visualización de ARNm tienen puromicina en su extremo 3'. A medida que avanza la traducción, el ribosoma se desplaza a lo largo de la plantilla de ARNm y, una vez que alcanza el extremo 3', la puromicina fusionada se une al sitio A del ribosoma y se incorpora al péptido naciente. Posteriormente, la fusión de ARNm y polipéptido se libera del ribosoma (Figura 1).

Para sintetizar una fusión de ARNm-polipéptido, la puromicina fusionada no es la única modificación del molde de ARNm. ^{[ 1 ]} Es necesario reclutar oligonucleótidos y otros espaciadores junto con la puromicina para proporcionar flexibilidad y la longitud adecuada para que la puromicina entre en el sitio A. Idealmente, el enlazador entre el extremo 3' de un ARNm y la puromicina debe ser flexible y lo suficientemente largo para permitir que la puromicina entre en el sitio A tras la traducción del último codón. Esto permite la producción eficiente de una fusión de ARNm-polipéptido de longitud completa y de alta calidad. Rihe Liu et al. optimizaron el espaciador de oligonucleótido de 3'-puromicina. Informaron que dA25 en combinación con un espaciador 9 (Glen Research) y dAdCdCP en el extremo 5' funcionaron mejor para la reacción de fusión. Encontraron que los enlazadores más largos de 40 nucleótidos y más cortos de 16 nucleótidos mostraron una eficiencia de formación de fusión muy reducida. Además, cuando la secuencia rUrUP se presentó adyacente a la puromicina, la fusión no se formó de manera eficiente. ^{[ 2 ]}

Además de proporcionar flexibilidad y longitud, la porción de poli dA del enlazador también permite una mayor purificación de la fusión de ARNm-polipéptido debido a su alta afinidad por la resina de celulosa dT. ^{[ 3 ]} Las fusiones de ARNm-polipéptido se pueden seleccionar sobre objetivos de selección inmovilizados durante varias rondas con rigurosidad creciente. Después de cada ronda de selección, aquellos miembros de la biblioteca que permanecen unidos al objetivo inmovilizado se amplifican mediante PCR y los que no se unen se eliminan mediante lavado.

La síntesis de una biblioteca de visualización de ARNm comienza con la síntesis de una biblioteca de ADN. Una biblioteca de ADN para cualquier proteína o péptido pequeño de interés puede sintetizarse mediante síntesis en fase sólida seguida de amplificación por PCR. Por lo general, cada miembro de esta biblioteca de ADN tiene un sitio de transcripción de la ARN polimerasa T7 y un sitio de unión ribosomal en el extremo 5'. La región promotora T7 permite la transcripción in vitro a gran escala de T7 para transcribir la biblioteca de ADN en una biblioteca de ARNm, que proporciona plantillas para la reacción de traducción in vitro posterior. El sitio de unión ribosomal en la región 5' no traducida (5' UTR) se diseña de acuerdo con el sistema de traducción in vitro que se utilizará. Hay dos sistemas de traducción in vitro populares disponibles comercialmente . Uno es el sistema de extracto S30 de E. coli (Promega) que requiere una secuencia Shine-Dalgarno en la 5' UTR como sitio de unión ribosomal; ^{[ 4 ]} el otro es Red Nova Lysate (Novagen), que necesita un sitio de unión ribosomal ΔTMV.

Una vez generada la biblioteca de ARNm, se purificará mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con urea (Urea-PAGE) y se ligará utilizando la ligasa de ADN T4 al espaciador de ADN que contiene puromicina en el extremo 3'. En este paso de ligación, un fragmento de ARNm se liga con una molécula de ADN monocatenario con la ayuda de la ligasa de ADN T4. Esta no es una reacción de ligación estándar con la ligasa de ADN T4, donde se ligan dos fragmentos de ADN bicatenario. Para aumentar el rendimiento de esta ligación especial, se puede utilizar un fragmento de ADN monocatenario para facilitar la reacción de ligación. El extremo 5' del fragmento está diseñado para ser complementario al extremo 3' del ARNm, y el extremo 3' del fragmento está diseñado para ser complementario al extremo 5' del espaciador de ADN, que generalmente consiste en nucleótidos de poli-dA (Figura 2).

La biblioteca de ARNm-ADN-puromicina ligada se traduce en el lisado Red Nova (Novagen) o en el sistema de extracto S30 de E. coli (Promega), lo que da como resultado polipéptidos unidos covalentemente en cis al ARNm codificante. La traducción in vitro también puede realizarse en un sistema PURE (síntesis de proteínas mediante elementos recombinantes). El sistema PURE es un sistema de traducción libre de células de E. coli en el que solo están presentes los componentes esenciales de la traducción. Algunos componentes, como los aminoácidos y las aminoacil-ARNt sintetasas (AARS), pueden omitirse del sistema. En su lugar, se puede añadir ARNt químicamente acilado al sistema PURE. Se ha demostrado que algunos aminoácidos no naturales, como el ARNt acilado con N-metilaminoácido, pueden incorporarse a péptidos o fusiones de ARNm-polipéptido en un sistema PURE. ^{[ 5 ]}

Tras la traducción, las porciones de ARNm monocatenario de las fusiones se convertirán en heterodúplex de ARN/ADN mediante transcriptasa inversa para eliminar cualquier estructura secundaria de ARN no deseada y estabilizar la porción de ácido nucleico de la fusión. Este paso es una reacción de transcripción inversa estándar. Por ejemplo, se puede realizar utilizando Superscript II (GIBCO-BRL) siguiendo el protocolo del fabricante.

Las fusiones de ARNm/ADN-polipéptido se pueden seleccionar sobre objetivos de selección inmovilizados durante varias rondas (Figura 3). Puede haber un ruido de fondo relativamente alto durante las primeras rondas de selección, lo cual se puede minimizar aumentando la rigurosidad de la selección, por ejemplo, ajustando la concentración de sal, la cantidad de detergente o la temperatura durante el período de unión del objetivo/fusión. Tras la selección por unión, los miembros de la biblioteca que permanecen unidos al objetivo inmovilizado se amplifican mediante PCR. El paso de amplificación por PCR enriquecerá la población de la biblioteca de visualización de ARNm que tenga mayor afinidad por el objetivo inmovilizado. También se puede realizar una PCR con propensión a errores entre cada ronda de selección para aumentar aún más la diversidad de la biblioteca de visualización de ARNm y reducir el ruido de fondo en la selección. ^{[ 6 ]}

Recientemente se publicó un protocolo menos laborioso para la visualización de ARNm. ^{[ 7 ]}

Aunque existen muchas otras tecnologías de visualización molecular, como la visualización de fagos , la visualización bacteriana , la visualización de levaduras y la visualización de ribosomas , la tecnología de visualización de ARNm tiene muchas ventajas sobre las demás. ^{[ 8 ]} Las tres primeras bibliotecas de visualización biológica enumeradas tienen polipéptidos o proteínas expresados ​​en la superficie del microorganismo correspondiente y la información de codificación que acompaña a cada polipéptido o proteína se puede recuperar del genoma del microorganismo. Sin embargo, el tamaño de la biblioteca para estos tres sistemas de visualización in vivo está limitado por la eficiencia de transformación de cada organismo. Por ejemplo, el tamaño de la biblioteca para la visualización de fagos y bacterias está limitado a 1-10 × 10^9 miembros diferentes. El tamaño de la biblioteca para la visualización de levaduras es aún menor. Además, estos sistemas de visualización basados ​​en células solo permiten la selección y el enriquecimiento de péptidos/proteínas que contienen aminoácidos naturales. En contraste, la visualización de ARNm y la visualización de ribosomas son métodos de selección in vitro . Permiten un tamaño de biblioteca de hasta 10^15 miembros diferentes. El gran tamaño de la biblioteca aumenta la probabilidad de seleccionar secuencias muy raras y también mejora la diversidad de las secuencias seleccionadas. Además, los métodos de selección in vitro eliminan la presión selectiva no deseada, como la baja expresión de proteínas y la rápida degradación de las mismas, que pueden reducir la diversidad de las secuencias seleccionadas. Finalmente, los métodos de selección in vitro permiten la aplicación de técnicas de mutagénesis in vitro ^{[ 9 ]} y recombinación a lo largo de todo el proceso de selección.

Aunque tanto la visualización de ribosomas como la de ARNm son métodos de selección in vitro , la visualización de ARNm tiene algunas ventajas sobre la tecnología de visualización de ribosomas. ^{[ 10 ]} La visualización de ARNm utiliza complejos covalentes de ARNm-polipéptido unidos mediante puromicina; mientras que la visualización de ribosomas utiliza complejos no covalentes de ribosoma-ARNm-polipéptido detenidos. ^{[ 11 ]} En la visualización de ribosomas, la rigurosidad de la selección se limita a mantener el complejo ribosoma-ARNm-polipéptido en un complejo debido a la naturaleza no covalente de estos complejos. Esto puede causar dificultades para reducir la unión de fondo durante el ciclo de selección. Además, los polipéptidos bajo selección en un sistema de visualización de ribosomas están unidos a un enorme complejo de ARNr-proteína, un ribosoma, que tiene un peso molecular de más de 2.000.000 Da. Podría existir alguna interacción impredecible entre el objetivo de selección y el ribosoma, lo que podría llevar a la pérdida de posibles ligandos durante el ciclo de selección. En cambio, el espaciador de ADN de puromicina utilizado en la tecnología de visualización de ARNm es mucho más pequeño que un ribosoma. Este espaciador tiene menos probabilidades de interactuar con una diana de selección inmovilizada. Por lo tanto, es más probable que la tecnología de visualización de ARNm proporcione resultados menos sesgados.

En 1997, Roberts y Szostak demostraron que las fusiones entre un ARNm sintético y su epítopo myc codificado podían enriquecerse a partir de un conjunto de fusiones de ARNm-polipéptido de secuencia aleatoria mediante inmunoprecipitación. ^{[ 6 ]}

Nueve años después, Fukuda y sus colegas eligieron el método de visualización de ARNm para la evolución in vitro de fragmentos de anticuerpos de cadena simple Fv (scFv). ^{[ 12 ]} Seleccionaron seis mutantes scFv diferentes con cinco mutaciones de consenso. Sin embargo, el análisis cinético de estos mutantes mostró que su especificidad antigénica seguía siendo similar a la del tipo silvestre. No obstante, demostraron que dos de las cinco mutaciones de consenso se encontraban dentro de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR). Concluyeron que la visualización de ARNm tiene el potencial de lograr una rápida evolución artificial de anticuerpos diagnósticos y terapéuticos de alta afinidad mediante la optimización de sus CDR.

Roberts y colaboradores han demostrado que los oligómeros peptídicos no naturales que contienen un aminoácido N-sustituido pueden sintetizarse como fusiones de ARNm-polipéptido. ^{[ 13 ]} Los péptidos que contienen aminoácidos N-sustituidos se han asociado con una buena estabilidad proteolítica y mejores propiedades farmacocinéticas. Este trabajo indica que la tecnología de visualización de ARNm tiene el potencial de seleccionar péptidos con propiedades farmacológicas para uso terapéutico, resistentes a la proteólisis. ^{[ 14 ]}

• Visualización de ribosomas
• Ingeniería de proteínas
• Detección de interacciones proteína-proteína