Etiquetado MS2

El etiquetado MS2 es una técnica basada en la interacción natural de la proteína de la cubierta del bacteriófago MS2 con una estructura de tallo-bucle del genoma del fago , ^{[ 1 ]} que se utiliza para la purificación bioquímica de complejos de ARN-proteína y se asocia con GFP para la detección de ARN en células vivas. ^{[ 2 ]} Más recientemente, la técnica se ha utilizado para monitorear la aparición de ARN en células vivas, en el sitio de transcripción, o simplemente observando los cambios en el número de ARN en el citoplasma . ^{[ 3 ] [ 4 ]} Esto ha revelado que la transcripción de genes tanto procariotas como eucariotas ocurre de manera discontinua con ráfagas de transcripción separadas por intervalos irregulares.

Se comienza con ARN monocatenario y se crea un patrón de estructuras de tallo-bucle añadiendo copias de las secuencias de unión a ARN de MS2 a una región no codificante. ^{[ 5 ]} La proteína MS2 debe fusionarse con GFP y unirse a un ARNm, un complejo que contiene copias de la secuencia de unión a ARN de MS2. ^{[ 5 ]} La proteína de fusión MS2-GFP se expresó transfiriéndola a una célula con un plásmido ^{[ 5 ]} (laboratorio de Robert Singer). La señal codificada dentro del ARN y la presencia de la señal de localización nuclear (NLS) dentro de GFP-MS2 son dos señales que se introducen desde los complejos EGFP-MS2-ARN. ^{[ 6 ]}

La purificación por afinidad de ARN marcado con biotina MS2 (MS2-BioTRAP) es un método in vivo para identificar interacciones proteína-ARN. ^{[ 7 ]} Tanto el ARN marcado con MS2 como la proteína MS2 se expresaron y, posteriormente, se utilizó la interacción por afinidad para facilitar el proceso de identificación de interacciones proteína-ARN. ^{[ 7 ]}

Ventajas:

El método MS2-BioTRAP es rápido, flexible y fácil de configurar; se adapta bien a diferentes escalas y permite estudiar las condiciones fisiológicas de las interacciones proteína-ARN. ^{[ 7 ]} La etiqueta MS2 también es eficaz para moléculas pequeñas cuando se utiliza una proteína de cubierta MS2 para aislar diversas partículas de ribonucleoproteínas (RNP) . ^{[ 8 ]}

Desventajas:

Una advertencia sobre el etiquetado con MS2 es que se necesitan agregar muchas copias del bucle-tallo MS2 dentro del ARN para producir suficiente señal para ver y rastrear una molécula de ARN en el núcleo. ^{[ 5 ]} Al rastrear más de una secuencia de ARN en el núcleo de células cultivadas, se necesita más de una secuencia objetivo. ^{[ 5 ]} Esto podría verse afectado por la proteína MS2, que tiene una señal de localización nuclear básica clásica (NLS), por lo que podría afectar la ubicación del complejo de ARN, y el núcleo tendría la mayor parte de GFP-MS2 ^{[ 5 ]} (laboratorio de Robert Singer). ^{[ 6 ]} La acumulación de GFP-MS2 en el núcleo dará como resultado fuertes señales de fluorescencia nuclear, lo que retrasará o impedirá el análisis de la localización nuclear del ARN porque obstaculizará el análisis del empalme, la edición de ARN , la exportación nuclear de ARN y la traducción de ARN. ^{[ 6 ]} Además, debido a la adición de la etiqueta, la estructura secundaria del ARN puede introducir un artefacto. ^{[ 5 ]}

Además, los niveles de expresión y las propiedades reguladoras del ARN pequeño no codificante (sRNA) se verán influenciados por la etiqueta MS2. ^{[ 8 ]} Asimismo, al utilizar MS2 como etiqueta de afinidad para purificar una proteína en bacterias E. coli , los científicos expresaron MS2-MBP, que es una proteína de la cubierta MS2 con mutaciones fusionada con proteínas de unión a maltosa . Las mutaciones impidieron la oligomerización . ^{[ 8 ]}