Ionización por electrospray con desorción láser asistida por matriz

La ionización por electrospray con desorción láser asistida por matriz ( MALDESI ) se introdujo por primera vez en 2006 como una novedosa técnica de ionización ambiental que combina los beneficios de la ionización por electrospray (ESI) y la desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI) . ^{[ 1 ]} En MALDESI se puede utilizar un láser infrarrojo (IR) o ultravioleta (UV) para excitar resonantemente una matriz endógena o exógena. El término " matriz " se refiere a cualquier molécula que está presente en gran exceso y absorbe la energía del láser, facilitando así la desorción de las moléculas del analito. El diseño original de MALDESI se implementó utilizando matrices orgánicas comunes , similares a las utilizadas en MALDI, junto con un láser UV. La fuente MALDESI actual emplea agua endógena o una capa delgada de hielo depositado exógenamente como matriz absorbente de energía, donde los enlaces de estiramiento simétricos y asimétricos de OH se excitan resonantemente mediante un láser de infrarrojo medio. ^{[ 2 ]}

La fuente IR-MALDESI se puede utilizar para la espectrometría de masas por imágenes (MSI) , una técnica que utiliza datos de MS analizados de un área de muestra para detectar cientos o miles de biomoléculas y visualizar sus distribuciones espaciales. La fuente IR-MALDESI MSI fue diseñada e implementada en 2013, ^{[ 3 ]} y está acoplada a un espectrómetro de masas híbrido de cuadrupolo - Orbitrap de alta resolución . La platina motorizada controlada por computadora y una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD) están ubicadas en un recinto purgado con nitrógeno donde se pueden regular los iones ambientales y la humedad relativa. Se utiliza una placa termoeléctrica Peltier refrigerada por agua para controlar la temperatura de la platina de la muestra (−10  °C a 80  °C). La fuente tiene capacidades de disparo único o múltiple con fluencia láser, frecuencia de repetición y retardo ajustables entre el disparo del láser y la acumulación de iones MS.

En los últimos diez años, los avances transformadores en la tecnología láser, ^{[ 4 ]} la adquisición de datos, el software de control de motores (RastirX ^{[ 5 ]} ) y el software de procesamiento de imágenes (MSiReader ^{[ 6 ] [ 7 ]} ) han promovido IR-MALDESI como una herramienta poderosa para el análisis directo y MSI de diversas muestras biológicas, forenses y farmacéuticas.

En un experimento típico de MALDESI MS, se deposita una fina capa de hielo sobre la muestra como medio absorbente de energía. Se utiliza un láser de infrarrojo medio ^{[ 4 ]} que excita el modo de estiramiento OH del agua para desorber los materiales neutros de las muestras biológicas. La pluma de compuestos desorbidos interactúa con una pluma de electrospray ortogonal donde se dividen en gotas de electrospray cargadas y se ionizan mediante un proceso similar a ESI. Los iones se introducen posteriormente en un espectrómetro de masas. ^{[ 2 ]} El mecanismo de ionización tipo ESI se ha demostrado experimentalmente y estudiado en profundidad, ^{[ 8 ] [ 9 ] [ 10 ]} mostrando una suavidad equivalente a la de ESI y permitiendo la detección de complejos proteicos intactos.

La formación de la matriz de hielo comienza con la purga del recinto a una humedad relativa inferior al 12 % con la fuente de nitrógeno seco antes de enfriar la etapa Peltier a −10  °C. Posteriormente, la muestra enfriada se expone a la humedad relativa ambiente, lo que provoca la rápida formación de una capa de hielo sobre la muestra. El espesor del hielo se mantiene durante todo el experimento manteniendo la humedad relativa del recinto al 10 % ± 2 % mediante la purga de nitrógeno. ^{[ 2 ]} Anteriormente, se utilizó hielo como matriz en experimentos IR-MALDI; ^{[ 11 ]} sin embargo, los rendimientos iónicos para dichos experimentos han sido muy bajos. La postionización por electrospray empleada en IR-MALDESI ayuda a mitigar los problemas asociados con el bajo rendimiento de ionización. Se ha demostrado que una matriz de hielo depositada exógenamente mejora la abundancia iónica en un factor de aproximadamente 15. ^{[ 12 ]}

MALDESI es un sistema interactivo complejo, lo que dificulta generar la geometría óptima en un solo experimento. Los parámetros experimentales involucrados en la comunicación entre la etapa de muestreo, el espectrómetro de masas y la desorción láser, como la altura de la etapa, la distancia ESI-Spot y la frecuencia de repetición del láser, se han optimizado progresivamente mediante varios diseños de experimentos (DOE). ^{[ 13 ] [ 9 ] [ 2 ]} Además de la optimización de la geometría de la fuente, la composición del disolvente de electrospray tiene un efecto en las señales MALDESI (es decir, influye en la cobertura molecular y la abundancia de iones). En un estudio para mejorar la detección de lípidos específicos de tejido, los parámetros de electrospray se han adaptado para polaridades de ionización positiva y negativa. Con los parámetros óptimos, las abundancias de lípidos aumentaron 3 veces con una cobertura un 15 % mayor en polaridad positiva, mientras que en modo negativo la abundancia de lípidos logró un aumento de 1,5 veces con una cobertura un 10 % mayor. ^{[ 14 ]}

Mientras que la primera generación del sistema MALDESI se acopló a un espectrómetro de masas de resonancia ciclotrónica de iones por transformada de Fourier (FT), ^{[ 3 ]} la fuente actual se conecta a un espectrómetro de masas Thermo Exploris 240 o Q Exactive Plus equipado con un analizador de masas Orbitrap . Estos analizadores de masas ofrecen mediciones de masa igualmente precisas, pero generalmente acortan la duración de la adquisición de datos. La fuente MALDESI también se puede acoplar a un espectrómetro de masas de movilidad iónica de tubo de deriva (IMS-MS) para cribado de alto rendimiento. ^{[ 15 ]} Estas integraciones proporcionan datos brutos más fiables para MSI, así como análisis directo de diversas muestras biológicas, ya que un tiempo de análisis prolongado podría causar cambios fisiológicos en las muestras analizadas.

MSiReader es una aplicación de Matlab que proporciona visualización y análisis de datos de masas de alta resolución y precisión obtenidos mediante MALDESI. MSiReader fue desarrollado en la Universidad Estatal de Carolina del Norte y se lanzó por primera vez en 2013. ^{[ 6 ]} Ahora se ha convertido en una de las opciones de software libre y de código abierto más importantes para datos MSI, ^{[ 7 ]} y es compatible con la mayoría de los formatos de datos MSI comunes (por ejemplo, mzXML, imzML, img, ASCII ). Hay muchas funciones esenciales disponibles en MSiReader, a saber, generación de mapas de calor con alta precisión de medición de masa, ^{[ 7 ]} normalización de picos, ^{[ 16 ]} cuantificación absoluta y relativa, ^{[ 7 ] [ 17 ]} y cambio de polaridad. ^{[ 18 ]} También se han añadido a MSiReader características avanzadas como análisis de componentes principales (MSiPCA), MSiCorrelation, ^{[ 19 ]} y visualización 3D ^{[ 20 ] [ 21 ]} . Hasta la fecha, MSiReader es utilizado por más de 1250 investigadores y citado en más de 325 publicaciones desde 2013. Se distribuye bajo la licencia de código abierto BSD 3 y puede descargarse gratuitamente desde el sitio web público de MSiReader: www.msireader.com . También está disponible una versión independiente que no requiere una licencia de Matlab.

El software Rastir, también basado en la plataforma Matlab, se desarrolló para permitir a los usuarios definir visualmente una región de interés (ROI) rectangular alrededor de una sección de tejido para experimentos MALDESI. Rastir genera automáticamente comandos de control de movimiento y parámetros de sincronización del láser y del instrumento para mover la platina de la muestra bajo el haz láser y adquirir los datos de espectrometría de masas vóxel a vóxel. La última versión del software, denominada RastirX, permite a los usuarios dibujar ROI arbitrarias en una imagen de vídeo en directo de una muestra con el ratón. La ROI se puede modificar posteriormente escaneo a escaneo, lo que reduce significativamente el tiempo de adquisición y la contaminación por compuestos externos al tejido en comparación con el uso de una ROI rectangular. Esta herramienta de ROI arbitraria se ha aplicado en varios proyectos. ^{[ 5 ] [ 22 ]}

Desde su debut en 2006, MALDESI ha experimentado grandes avances en tecnología láser (desde láseres UV hasta varios láseres de longitud de onda IR media), ^{[ 1 ] [ 4 ] [ 23 ]} configuraciones ESI ^{[ 9 ] [ 13 ] [ 14 ]} y software asociado. ^{[ 5 ] [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ]} Todo el progreso ha hecho de IR-MALDESI una herramienta competitiva de imágenes y análisis directo para investigar una amplia variedad de muestras biológicas. Al asociar m/z con posiciones donde se adquieren, se pueden generar mapas de iones únicos de analitos, lo que proporciona información valiosa para distribuciones espaciales de lípidos , péptidos , metabolómica y otras pequeñas biomoléculas desde muestras de mamíferos ^{[ 1 ] [ 12 ] [ 21 ] [ 23 ] [ 14 ] [ 24 ]} hasta tejidos vegetales. ^{[ 25 ] [ 26 ] [ 27 ]}

Existen otros métodos de ionización híbrida que combinan la desorción láser resonante o no resonante con la ionización posterior por electrospray. Un ejemplo es la ionización por desorción láser por electrospray (ELDI), que utiliza un láser ultravioleta para formar iones irradiando directamente la muestra, interactuando posteriormente con la pluma de electrospray sin utilizar matrices. ^{[ 40 ]} La versión infrarroja de ELDI se conoce como ionización por electrospray por ablación láser (LAESI). IR-MALDESI se diferencia de estos dos métodos en que se utiliza una matriz de hielo exógena para mejorar la desorción de la muestra, así como los parámetros geométricos de la fuente. Otra técnica, la fotoionización por desorción a presión atmosférica (DAPPI), utiliza un chorro de vapor de disolvente calentado para desorber los analitos de la superficie de la muestra mediante un microchip nebulizador. Las moléculas desorbidas se ionizan posteriormente mediante fotones emitidos por una lámpara UV y se introducen en espectrómetros de masas. ^{[ 41 ]}