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Biología molecular

El dogma central de la biología molecular que muestra el flujo de información genética dentro de un sistema biológico. Ejemplo de un concepto de biología molecular. Modelo que m...

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El dogma central de la biología molecular que muestra el flujo de información genética dentro de un sistema biológico.
Ejemplo de un concepto de biología molecular. Modelo que muestra las interacciones entre el ADN y las proteínas durante la replicación del ADN : cadena molde de ADN (amarilla), cadena hija de ADN recién sintetizada (cian), tres subunidades de PCNA (tonos de azul) y la subunidad catalítica de la ADN polimerasa ε (verde).

La biología molecular es una rama de la biología que busca comprender las estructuras moleculares y los procesos químicos que constituyen la base de la actividad biológica dentro y entre las células . Se centra principalmente en el estudio de los ácidos nucleicos (como el ADN y el ARN ) y las proteínas . Examina la estructura, la función y las interacciones de estas macromoléculas a medida que orquestan procesos como la replicación , la transcripción , la traducción , la síntesis de proteínas y las interacciones biomoleculares complejas . El campo de la biología molecular es multidisciplinario y se basa en principios de la genética , la bioquímica , la física, las matemáticas y, más recientemente, la informática ( bioinformática ). [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ]

Aunque las células y otras estructuras microscópicas se habían observado en organismos ya en el siglo XVIII, una comprensión detallada de los mecanismos e interacciones que rigen su comportamiento no surgió hasta el siglo XX, cuando las tecnologías utilizadas en física y química habían avanzado lo suficiente como para permitir su aplicación en las ciencias biológicas. El término "biología molecular" fue utilizado por primera vez en 1945 por el físico inglés William Astbury , quien lo describió como un enfoque centrado en discernir los fundamentos de los fenómenos biológicos, es decir, descubrir las estructuras y propiedades físicas y químicas de las moléculas biológicas, así como sus interacciones con otras moléculas y cómo estas interacciones explican las observaciones de la llamada biología clásica, que en cambio estudia los procesos biológicos a escalas mayores y niveles de organización superiores. [ 4 ] En 1953, Francis Crick , James Watson , Rosalind Franklin y sus colegas de la Unidad del Consejo de Investigación Médica, Laboratorio Cavendish , fueron los primeros en describir el modelo de doble hélice para la estructura química del ácido desoxirribonucleico (ADN), lo que a menudo se considera un hito para el campo naciente porque proporcionó una base fisicoquímica para comprender la idea previamente vaga de los ácidos nucleicos como la sustancia primaria de la herencia biológica. Propusieron esta estructura basándose en investigaciones previas realizadas por Franklin, que les fueron transmitidas por Maurice Wilkins y Max Perutz . [ 5 ] Su trabajo condujo al descubrimiento de ADN en otros microorganismos, plantas y animales. [ 6 ]

El campo de la biología molecular incluye técnicas que permiten a los científicos estudiar los procesos moleculares. [ 7 ] Estas técnicas se utilizan para dirigir eficazmente nuevos fármacos, diagnosticar enfermedades y comprender mejor la fisiología celular. [ 8 ] Algunas investigaciones clínicas y terapias médicas derivadas de la biología molecular se engloban dentro de la terapia génica , mientras que el uso de la biología molecular o la biología celular molecular en medicina se denomina ahora medicina molecular . [ 9 ]

Historia de la biología molecular

Descripción de ángulos en la estructura del ADN
Representación esquemática de la estructura del ADN de Watson y Crick

La biología molecular se sitúa en la intersección de la bioquímica y la genética ; a medida que estas disciplinas científicas surgieron y evolucionaron en el siglo XX, quedó claro que ambas buscaban determinar los mecanismos moleculares que subyacen a las funciones celulares vitales. [ 10 ] [ 11 ] Los avances en biología molecular han estado estrechamente relacionados con el desarrollo de nuevas tecnologías y su optimización. [ 12 ]

El campo de la genética surgió de los intentos por comprender el conjunto de reglas que rigen la reproducción y la herencia , y la naturaleza de las unidades hipotéticas de la herencia conocidas como genes . Gregor Mendel fue pionero en este trabajo en 1866, cuando describió por primera vez las leyes de la herencia que observó en sus estudios de cruces de plantas de guisantes. [ 13 ] Una de estas leyes de la herencia genética es la ley de segregación , que establece que los individuos diploides con dos alelos para un gen en particular transmitirán uno de estos alelos a su descendencia. [ 14 ] Debido a su trabajo fundamental, el estudio de la herencia genética se conoce comúnmente como genética mendeliana . [ 15 ]

Un hito importante en la biología molecular fue el descubrimiento de la estructura del ADN . Este trabajo comenzó en 1869 por Friedrich Miescher , un bioquímico suizo que propuso por primera vez una estructura llamada nucleína , que ahora sabemos que es (ácido desoxirribonucleico), o ADN. [ 16 ] Descubrió esta sustancia única estudiando los componentes de vendajes llenos de pus y notando las propiedades únicas de las "sustancias que contienen fósforo". [ 17 ] Otro contribuyente notable al modelo del ADN fue Phoebus Levene , quien propuso el "modelo de polinucleótidos" del ADN en 1919 como resultado de sus experimentos bioquímicos en levadura. [ 18 ] En 1950, Erwin Chargaff amplió el trabajo de Levene y dilucidó algunas propiedades críticas de los ácidos nucleicos: primero, la secuencia de ácidos nucleicos varía entre especies. [ 19 ] En segundo lugar, la concentración total de purinas (adenina y guanina) siempre es igual a la concentración total de pirimidinas (citosina y timina). [ 16 ] Esto se conoce ahora como la regla de Chargaff. En 1953, James Watson y Francis Crick publicaron la estructura de doble hélice del ADN, [ 20 ] basándose en el trabajo de cristalografía de rayos X realizado por Rosalind Franklin , que les fue transmitido por Maurice Wilkins y Max Perutz . [ 5 ] Watson y Crick describieron la estructura del ADN y conjeturaron sobre las implicaciones de esta estructura única para posibles mecanismos de replicación del ADN. [ 20 ] Watson y Crick recibieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1962, junto con Wilkins, por proponer un modelo de la estructura del ADN. [ 6 ]

En 1961, se demostró que cuando un gen codifica una proteína , tres bases secuenciales del ADN del gen especifican cada aminoácido sucesivo de la proteína. [ 21 ] Por lo tanto, el código genético es un código de tripletes, donde cada triplete (llamado codón ) especifica un aminoácido particular. Además, se demostró que los codones no se superponen entre sí en la secuencia de ADN que codifica una proteína, y que cada secuencia se lee desde un punto de partida fijo. Durante 1962-1964, mediante el uso de mutantes letales condicionales de un virus bacteriano, [ 22 ] se lograron avances fundamentales en nuestra comprensión de las funciones e interacciones de las proteínas empleadas en la maquinaria de replicación del ADN , reparación del ADN , recombinación del ADN y en el ensamblaje de estructuras moleculares. [ 23 ]

El experimento de Griffith

El experimento de Griffith

En 1928, Frederick Griffith descubrió una propiedad de virulencia en la bacteria neumococo , que estaba matando ratas de laboratorio. Según Mendel, la teoría predominante en aquel entonces sostenía que la transferencia de genes solo podía ocurrir de células progenitoras a células hijas. Griffith propuso otra teoría, afirmando que la transferencia de genes que ocurre entre miembros de la misma generación se conoce como transferencia horizontal de genes (THG). Este fenómeno se denomina actualmente transformación genética. [ 24 ]

El experimento de Griffith se centró en la bacteria neumococo, que presentaba dos cepas diferentes: una virulenta y lisa, y otra avirulenta y rugosa. La cepa lisa tenía un aspecto brillante debido a la presencia de un tipo específico de polisacárido: una cápsula de polímero de glucosa y ácido glucurónico. Gracias a esta capa de polisacáridos, el sistema inmunitario del huésped no puede reconocer la bacteria y la mata. La cepa rugosa carece de esta cápsula de polisacáridos, lo que resulta en una colonia opaca y rugosa, y la hace avirulenta, ya que el sistema inmunitario del huésped la reconoce y destruye con mayor facilidad. [ 25 ]

Se sabe que la presencia o ausencia de una cápsula en la cepa está determinada genéticamente. Las cepas lisas y rugosas se presentan en varios tipos diferentes, como SI, S-II, S-III, etc., y RI, R-II, R-III, etc., respectivamente. Todos estos subtipos de bacterias S y R difieren entre sí en el tipo de antígeno que producen. [ 6 ]

Experimento de Avery-MacLeod-McCarty

El experimento Avery-MacLeod-McCarty fue una demostración experimental realizada por Oswald Avery , Colin MacLeod y Maclyn McCarty que, en 1944, informó que el ADN es la sustancia que causa la transformación bacteriana , en una época en la que se creía ampliamente que eran las proteínas las que cumplían la función de transportar la información genética (de hecho, la palabra proteína se acuñó para indicar la creencia de que su función era primaria ). Fue la culminación de la investigación realizada en la década de 1930 y principios del siglo XX en el Instituto Rockefeller de Investigación Médica para purificar y caracterizar el "principio transformador" responsable del fenómeno de transformación descrito por primera vez en el experimento de Griffith de 1928: Streptococcus pneumoniae muerto de la cepa virulenta tipo III-S, cuando se inyectó junto con neumococos vivos pero no virulentos de tipo II-R, resultó en una infección mortal de neumococos de tipo III-S. En su artículo « Estudios sobre la naturaleza química de la sustancia que induce la transformación de los tipos de neumococo: Inducción de la transformación por una fracción de ácido desoxirribonucleico aislada del neumococo tipo III », publicado en el número de febrero de 1944 del Journal of Experimental Medicine , Avery y sus colegas sugieren que el ADN, en lugar de las proteínas como se creía ampliamente en ese momento, podría ser el material hereditario de las bacterias, y podría ser análogo a los genes y/o virus en organismos superiores. [ 26 ] [ 27 ]

Experimento de Hershey-Chase

Experimento de Hershey-Chase

La confirmación de que el ADN es el material genético causante de la infección provino del experimento de Hershey-Chase . Utilizaron E. coli y bacteriófagos para el experimento. Este experimento también se conoce como el experimento de la licuadora, ya que se utilizó una licuadora de cocina como elemento principal del aparato. Alfred Hershey y Martha Chase demostraron que el ADN inyectado por una partícula de fago en una bacteria contiene toda la información necesaria para sintetizar partículas de fago descendientes. Utilizaron radiactividad para marcar la cubierta proteica del bacteriófago con azufre radiactivo y el ADN con fósforo radiactivo, en dos tubos de ensayo diferentes respectivamente. Después de mezclar el bacteriófago y la E. coli en el tubo de ensayo, comienza el período de incubación en el que el fago inyecta su material genético en las células de E. coli . Luego, la mezcla se mezcla o agita, lo que separa el fago de las células de E. coli . Toda la mezcla se centrifuga y se examina el sedimento que contiene las células de E. coli , y el sobrenadante se desecha. Las células de E. coli mostraron fósforo radiactivo, lo que indicaba que el material inyectado era ADN y no la cubierta proteica.

El ADN inyectado se replica dentro de las células de E. coli y dirige la síntesis de partículas fágicas descendientes. El proceso relacionado de transducción , descrito por Zinder y Lederberg, también es un tipo de transferencia horizontal de genes. La transducción es un proceso en el que un bacteriófago transporta un fragmento de ADN bacteriano y lo transfiere a otra bacteria. Esto también es un tipo de transferencia horizontal de genes. [ 6 ]

Experimento de Meselson-Stahl

Experimento de Meselson-Stahl

El experimento de Meselson-Stahl fue realizado por Matthew Meselson y Franklin Stahl en 1958 y apoyó la hipótesis de Watson y Crick de que la replicación del ADN era semiconservativa . En la replicación semiconservativa, cuando se replica la hélice de ADN de doble cadena , cada una de las dos nuevas hélices de ADN de doble cadena consta de una hebra de la hélice original y una recién sintetizada. Ha sido llamado "el experimento más hermoso de la biología". [ 28 ] Meselson y Stahl decidieron que la mejor manera de rastrear el ADN parental sería marcarlo cambiando uno de sus átomos. Dado que el nitrógeno está presente en todas las bases del ADN , generaron ADN parental que contenía un isótopo de nitrógeno sustancialmente más pesado que el que estaría presente de forma natural. Esta masa alterada les permitió rastrear y determinar cuánto del ADN parental estaba presente en el ADN después de sucesivos ciclos de replicación.

Biología molecular moderna

A principios de la década de 2020, la biología molecular entró en una época dorada definida por el desarrollo técnico tanto vertical como horizontal. Verticalmente, las nuevas tecnologías permiten la monitorización en tiempo real de los procesos biológicos a nivel atómico. [ 29 ] Los biólogos moleculares tienen acceso hoy a datos de secuenciación cada vez más asequibles y con mayor profundidad, lo que facilita el desarrollo de nuevos métodos de manipulación genética en organismos no modelo. Asimismo, los biólogos moleculares sintéticos impulsarán la producción industrial de moléculas pequeñas y macromoléculas mediante la introducción de vías metabólicas exógenas en diversas líneas celulares procariotas y eucariotas. [ 30 ]

Horizontalmente, los datos de secuenciación son cada vez más asequibles y se utilizan en diversos campos científicos. Esto impulsará el desarrollo de industrias en países en desarrollo y aumentará el acceso para investigadores individuales. Asimismo, los experimentos de edición genética CRISPR-Cas9 ahora pueden ser concebidos e implementados por particulares por menos de 10 000 dólares en organismos novedosos, lo que impulsará el desarrollo de aplicaciones industriales y médicas. [ 31 ]

Relación con otras ciencias biológicas

Relación esquemática entre bioquímica , genética y biología molecular.

La siguiente lista describe un punto de vista sobre las relaciones interdisciplinarias entre la biología molecular y otros campos relacionados. [ 32 ]

Si bien los investigadores emplean técnicas específicas de la biología molecular, es común combinarlas con métodos de la genética y la bioquímica . Gran parte de la biología molecular es cuantitativa, y recientemente se ha realizado un trabajo significativo utilizando técnicas de informática como la bioinformática y la biología computacional . La genética molecular , el estudio de la estructura y función de los genes, ha sido uno de los subcampos más destacados de la biología molecular desde principios de la década de 2000. Otras ramas de la biología se nutren de la biología molecular, ya sea estudiando directamente las interacciones de las moléculas en sí mismas, como en la biología celular y la biología del desarrollo , o indirectamente, donde se utilizan técnicas moleculares para inferir atributos históricos de poblaciones o especies , como en campos de la biología evolutiva como la genética de poblaciones y la filogenética . También existe una larga tradición de estudiar biomoléculas "desde cero", o molecularmente, en biofísica . [ 35 ]

Técnicas de biología molecular

animación de ADN

Clonación molecular

Imagen de transducción

La clonación molecular se utiliza para aislar y luego transferir una secuencia de ADN de interés a un vector plasmídico. [ 36 ] Esta tecnología de ADN recombinante se desarrolló por primera vez en la década de 1960. [ 37 ] En esta técnica, una secuencia de ADN que codifica una proteína de interés se clona utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y/o enzimas de restricción en un plásmido ( vector de expresión ). El vector plasmídico generalmente tiene al menos tres características distintivas: un origen de replicación, un sitio de clonación múltiple (MCS) y un marcador selectivo (generalmente resistencia a antibióticos ). Además, aguas arriba del MCS se encuentran las regiones promotoras y el sitio de inicio de la transcripción , que regulan la expresión del gen clonado.

Este plásmido puede insertarse tanto en células bacterianas como animales. La introducción de ADN en células bacterianas puede realizarse mediante transformación por captación de ADN desnudo, conjugación por contacto célula-célula o transducción mediante vector viral. La introducción de ADN en células eucariotas , como las células animales , por medios físicos o químicos se denomina transfección . Existen diversas técnicas de transfección, como la transfección con fosfato de calcio, la electroporación , la microinyección y la transfección con liposomas . El plásmido puede integrarse en el genoma , dando lugar a una transfección estable, o bien permanecer independiente del genoma y expresarse temporalmente, lo que se denomina transfección transitoria. [ 38 ] [ 39 ]

El ADN que codifica una proteína de interés se encuentra ahora dentro de la célula, y la proteína puede expresarse. Se dispone de diversos sistemas, como promotores inducibles y factores de señalización celular específicos, para ayudar a expresar la proteína de interés a altos niveles. Posteriormente, se pueden extraer grandes cantidades de la proteína de la célula bacteriana o eucariota. La proteína puede analizarse para determinar su actividad enzimática en diversas condiciones, puede cristalizarse para estudiar su estructura terciaria o, en la industria farmacéutica, puede estudiarse la actividad de nuevos fármacos contra la proteína. [ 40 ]

reacción en cadena de la polimerasa

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica extremadamente versátil para la replicación del ADN. En resumen, la PCR permite copiar o modificar una secuencia de ADN específica de maneras predeterminadas. La reacción es extremadamente potente y, en condiciones óptimas, puede amplificar una molécula de ADN hasta convertirla en 1070 millones de moléculas en menos de dos horas. La PCR tiene numerosas aplicaciones, entre ellas el estudio de la expresión génica, la detección de microorganismos patógenos, la detección de mutaciones genéticas y la introducción de mutaciones en el ADN. [ 41 ] La técnica de PCR se puede utilizar para introducir sitios de enzimas de restricción en los extremos de las moléculas de ADN o para mutar bases específicas del ADN; este último método se conoce como mutagénesis dirigida . La PCR también se puede utilizar para determinar si un fragmento de ADN específico se encuentra en una biblioteca de ADNc . La PCR tiene muchas variantes, como la PCR de transcripción inversa ( RT-PCR ) para la amplificación de ARN y, más recientemente, la PCR cuantitativa, que permite la medición cuantitativa de moléculas de ADN o ARN. [ 42 ] [ 43 ]

Gel de agarosa al dos por ciento en tampón de borato, preparado en una bandeja para gel.

electroforesis en gel

Página SDS

La electroforesis en gel es una técnica que separa moléculas según su tamaño utilizando un gel de agarosa o poliacrilamida. [ 44 ] Esta técnica es una de las principales herramientas de la biología molecular. El principio básico es que los fragmentos de ADN se pueden separar aplicando una corriente eléctrica a través del gel; debido a que la cadena principal del ADN contiene grupos fosfato con carga negativa, el ADN migrará a través del gel de agarosa hacia el extremo positivo de la corriente. [ 44 ] Las proteínas también se pueden separar según su tamaño utilizando un gel SDS-PAGE , o según su tamaño y su carga eléctrica utilizando lo que se conoce como electroforesis en gel 2D . [ 45 ]

Proteínas teñidas en un gel PAGE con colorante azul de Coomassie.

El ensayo de proteínas de Bradford

El ensayo de Bradford es una técnica de biología molecular que permite la cuantificación rápida y precisa de moléculas de proteína utilizando las propiedades únicas de un colorante llamado Azul Brillante de Coomassie G-250. [ 46 ] El Azul de Coomassie experimenta un cambio de color visible de marrón rojizo a azul brillante al unirse a la proteína. [ 46 ] En su estado catiónico inestable, el Azul de Coomassie tiene una longitud de onda de fondo de 465  nm y emite un color marrón rojizo. [ 47 ] Cuando el Azul de Coomassie se une a la proteína en una solución ácida, la longitud de onda de fondo cambia a 595  nm y el colorante emite un color azul brillante. [ 47 ] Las proteínas en el ensayo se unen al Azul de Coomassie en aproximadamente 2 minutos, y el complejo proteína-colorante es estable durante aproximadamente una hora, aunque se recomienda que las lecturas de absorbancia se tomen dentro de los 5 a 20 minutos del inicio de la reacción. [ 46 ] La concentración de proteína en el ensayo de Bradford se puede medir utilizando un espectrofotómetro de luz visible y, por lo tanto, no requiere un equipo extenso. [ 47 ]

Este método fue desarrollado en 1975 por Marion M. Bradford y ha permitido una cuantificación de proteínas significativamente más rápida y precisa en comparación con los métodos anteriores: el procedimiento de Lowry y el ensayo de biuret. [ 46 ] A diferencia de los métodos anteriores, el ensayo de Bradford no es susceptible a la interferencia de varias moléculas no proteicas, como el etanol, el cloruro de sodio y el cloruro de magnesio. [ 46 ] Sin embargo, es susceptible a la influencia de agentes tamponadores alcalinos fuertes, como el dodecilsulfato de sodio (SDS). [ 46 ]

Transferencia y sondeo de macromoléculas

Los términos transferencia norte , transferencia oeste y transferencia estelar derivan de lo que inicialmente fue una broma de biología molecular que jugaba con el término transferencia sur , en referencia a la técnica descrita por Edwin Southern para la hibridación de ADN transferido. Patricia Thomas, creadora de la transferencia de ARN, que posteriormente se conoció como transferencia norte , en realidad no utilizó dicho término. [ 48 ]

Transferencia Southern

La técnica Southern blot , que recibe su nombre del biólogo Edwin Southern , es un método para detectar la presencia de una secuencia de ADN específica en una muestra de ADN. Las muestras de ADN, antes o después de la digestión con enzimas de restricción (endonucleasas de restricción), se separan mediante electroforesis en gel y luego se transfieren a una membrana por capilaridad . La membrana se expone a una sonda de ADN marcada con una secuencia de bases complementaria a la secuencia del ADN de interés. [ 49 ] El Southern blot se utiliza con menos frecuencia en laboratorios científicos debido a la capacidad de otras técnicas, como la PCR , para detectar secuencias de ADN específicas en muestras de ADN. Sin embargo, estas técnicas aún se utilizan en algunas aplicaciones, como la medición del número de copias de transgenes en ratones transgénicos o la ingeniería de líneas celulares de células madre embrionarias con genes inactivados . [ 35 ]

Northern blotting

Diagrama de Northern blot

La transferencia Northern se utiliza para estudiar la presencia de moléculas de ARN específicas mediante una comparación relativa entre un conjunto de diferentes muestras de ARN. Esencialmente, es una combinación de electroforesis en gel de ARN desnaturalizante y una transferencia . En este proceso, el ARN se separa según su tamaño y luego se transfiere a una membrana que se hibrida con un complemento marcado de una secuencia de interés. Los resultados pueden visualizarse de diversas maneras, dependiendo del marcador utilizado; sin embargo, la mayoría revelan bandas que representan los tamaños del ARN detectado en la muestra. La intensidad de estas bandas está relacionada con la cantidad de ARN diana en las muestras analizadas. El procedimiento se utiliza comúnmente para estudiar cuándo y cuánta expresión génica ocurre, midiendo la cantidad de ese ARN presente en diferentes muestras, asumiendo que no hay regulación postranscripcional y que los niveles de ARNm reflejan niveles proporcionales de la proteína correspondiente que se produce. Es una de las herramientas más básicas para determinar en qué momento y bajo qué condiciones se expresan ciertos genes en tejidos vivos. [ 50 ] [ 51 ]

Western blotting

Un Western blot es una técnica que permite detectar proteínas específicas a partir de una mezcla de proteínas. [ 52 ] Los Western blots se pueden utilizar para determinar el tamaño de las proteínas aisladas, así como para cuantificar su expresión. [ 53 ] En el Western blot , las proteínas se separan primero por tamaño en un gel delgado intercalado entre dos placas de vidrio, mediante una técnica conocida como SDS-PAGE . A continuación, las proteínas del gel se transfieren a una membrana de soporte de fluoruro de polivinilideno (PVDF), nitrocelulosa, nailon u otro material. Esta membrana se puede incubar con soluciones de anticuerpos . Los anticuerpos que se unen específicamente a la proteína de interés se pueden visualizar mediante diversas técnicas, como productos coloreados, quimioluminiscencia o autorradiografía . Con frecuencia, los anticuerpos se marcan con enzimas. Cuando un sustrato quimioluminiscente se expone a la enzima , permite su detección. El uso de técnicas de Western blot permite no solo la detección, sino también el análisis cuantitativo. Se pueden utilizar métodos análogos al Western blot para teñir directamente proteínas específicas en células vivas o secciones de tejido . [ 52 ] [ 54 ]

Transferencia oriental

La técnica de transferencia Eastern se utiliza para detectar modificaciones postraduccionales de proteínas. Las proteínas transferidas a la membrana de PVDF o nitrocelulosa se analizan para detectar modificaciones utilizando sustratos específicos. [ 55 ]

Microarrays

Se está imprimiendo un microchip de ADN.
Hibridación del objetivo con la sonda.

Un microarreglo de ADN es una colección de puntos adheridos a un soporte sólido, como un portaobjetos de microscopio , donde cada punto contiene uno o más fragmentos de oligonucleótidos de ADN monocatenario . Los microarreglos permiten colocar grandes cantidades de puntos muy pequeños (100 micrómetros de diámetro) en un solo portaobjetos. Cada punto tiene una molécula de fragmento de ADN que es complementaria a una única secuencia de ADN . Una variación de esta técnica permite calificar la expresión génica de un organismo en una etapa particular de desarrollo ( perfil de expresión ). En esta técnica, el ARN de un tejido se aísla y se convierte en ADN complementario (ADNc) marcado. Este ADNc se hibrida con los fragmentos del microarreglo y se puede visualizar la hibridación. Dado que se pueden crear múltiples microarreglos con la misma posición exacta de los fragmentos, son particularmente útiles para comparar la expresión génica de dos tejidos diferentes, como un tejido sano y uno canceroso. Además, se puede medir qué genes se expresan y cómo cambia esa expresión con el tiempo o con otros factores. Hay muchas maneras diferentes de fabricar microarreglos; Los más comunes son los chips de silicio, las láminas de microscopio con puntos de aproximadamente 100 micrómetros de diámetro, las matrices personalizadas y las matrices con puntos más grandes en membranas porosas (macromatrices). Una matriz puede contener desde 100 hasta más de 10 000 puntos. También se pueden fabricar matrices con moléculas distintas del ADN. [ 56 ] [ 57 ] [ 58 ] [ 59 ]

Oligonucleótido específico de alelo

El oligonucleótido específico de alelo (ASO) es una técnica que permite la detección de mutaciones de una sola base sin necesidad de PCR o electroforesis en gel. Sondas cortas (de 20 a 25 nucleótidos de longitud) marcadas se exponen al ADN diana no fragmentado, la hibridación ocurre con alta especificidad debido a la corta longitud de las sondas e incluso un solo cambio de base impedirá la hibridación. Luego se lava el ADN diana y se eliminan las sondas no hibridadas. Luego se analiza el ADN diana para detectar la presencia de la sonda mediante radiactividad o fluorescencia. En este experimento, como en la mayoría de las técnicas de biología molecular, se debe utilizar un control para garantizar el éxito de la experimentación. [ 60 ] [ 61 ] En biología molecular, los procedimientos y las tecnologías se desarrollan continuamente y las tecnologías más antiguas se abandonan. Por ejemplo, antes del advenimiento de la electroforesis en gel de ADN ( agarosa o poliacrilamida ), el tamaño de las moléculas de ADN se determinaba típicamente mediante sedimentación de velocidad en gradientes de sacarosa , una técnica lenta y laboriosa que requería instrumentación costosa; Antes de los gradientes de sacarosa, se utilizaba la viscometría . Más allá de su interés histórico, a menudo vale la pena conocer las tecnologías antiguas, ya que en ocasiones resultan útiles para resolver nuevos problemas para los que la técnica más reciente no es apropiada. [ 62 ]

Véase también

Referencias

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  • Logotipo de Wikimedia CommonsContenido multimedia relacionado con la biología molecular en Wikimedia Commons.
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