lector de placas

La detección de absorbancia ha estado disponible en lectores de microplacas durante más de 3 décadas y se utiliza para ensayos como ensayos ELISA , cuantificación de proteínas y ácidos nucleicos o ensayos de actividad enzimática ^{[ 2 ]} (es decir, en el ensayo MTT para viabilidad celular). ^{[ 3 ]} Una fuente de luz ilumina la muestra utilizando una longitud de onda específica (seleccionada por un filtro óptico o un monocromador), y un detector de luz ubicado en el otro lado del pozo mide cuánta de la luz inicial (100%) se transmite a través de la muestra: la cantidad de luz transmitida generalmente estará relacionada con la concentración de la molécula de interés. Varios análisis colorimétricos convencionales se han miniaturizado para funcionar cuantitativamente en un lector de placas, con un rendimiento adecuado para fines de investigación. Ejemplos de análisis convertidos a métodos de lector de placas incluyen varios para amonio , nitrato , nitrito , ^{[ 4 ]} urea , ^{[ 5 ]} hierro(II), ^{[ 6 ]} y ortofosfato . ^{[ 7 ]} Se han desarrollado químicas colorimétricas más recientes directamente para su uso en lectores de placas. ^{[ 8 ]}

La detección de intensidad de fluorescencia se ha desarrollado ampliamente en el formato de microplaca durante las últimas dos décadas. El rango de aplicaciones es mucho más amplio que cuando se utiliza la detección de absorbancia, pero la instrumentación suele ser más costosa. En este tipo de instrumentación, un primer sistema óptico (sistema de excitación) ilumina la muestra con una longitud de onda específica (seleccionada por un filtro óptico o un monocromador). Como resultado de la iluminación, la muestra emite luz (fluoresce) y un segundo sistema óptico (sistema de emisión) recoge la luz emitida, la separa de la luz de excitación (mediante un filtro o un monocromador) y mide la señal con un detector de luz, como un tubo fotomultiplicador (PMT). Las ventajas de la detección de fluorescencia sobre la detección de absorbancia son la sensibilidad y el rango de aplicaciones, dada la amplia selección de marcadores fluorescentes disponibles en la actualidad. Por ejemplo, una técnica conocida como imagen de calcio mide la intensidad de fluorescencia de colorantes sensibles al calcio para evaluar los niveles de calcio intracelular. ^{[ 9 ]}

La luminiscencia es el resultado de una reacción química o bioquímica. La detección por luminiscencia es ópticamente más sencilla que la detección por fluorescencia, ya que la luminiscencia no requiere una fuente de luz para la excitación ni óptica para seleccionar longitudes de onda de excitación específicas. Un sistema óptico típico para la detección de luminiscencia consta de una cámara de lectura hermética a la luz y un detector PMT . Algunos lectores de placas utilizan un detector PMT analógico, mientras que otros emplean un detector PMT de conteo de fotones . El conteo de fotones es ampliamente reconocido como el método más sensible para detectar la luminiscencia. Algunos lectores de placas ofrecen sistemas ópticos con rueda de filtros o monocromador de longitud de onda ajustable para seleccionar longitudes de onda luminiscentes específicas. La capacidad de seleccionar múltiples longitudes de onda, o incluso rangos de longitud de onda, permite la detección de ensayos que contienen múltiples enzimas reporteras luminiscentes, el desarrollo de nuevos ensayos de luminiscencia, así como la optimización de la relación señal-ruido.

Las aplicaciones comunes incluyen ensayos de expresión génica basados ​​en luciferasa , así como ensayos de viabilidad celular, citotoxicidad y biorritmos basados ​​en la detección luminiscente de ATP . ^{[ 10 ]}

La medición de fluorescencia resuelta en el tiempo (TRF) es muy similar a la medición de intensidad de fluorescencia (FI). La única diferencia radica en la sincronización del proceso de excitación/medición. Al medir FI, los procesos de excitación y emisión son simultáneos: la luz emitida por la muestra se mide mientras se produce la excitación. Si bien los sistemas de emisión son muy eficientes para eliminar la luz de excitación antes de que llegue al detector, la cantidad de luz de excitación en comparación con la luz de emisión es tal que las mediciones de FI siempre presentan señales de fondo bastante elevadas. La TRF ofrece una solución a este problema. Se basa en el uso de moléculas fluorescentes muy específicas, llamadas lantánidos , que poseen la propiedad inusual de emitir durante largos períodos de tiempo (medidos en milisegundos) después de la excitación, mientras que la mayoría de los colorantes fluorescentes estándar (por ejemplo, la fluoresceína) emiten en pocos nanosegundos tras ser excitados. Como resultado, es posible excitar los lantánidos utilizando una fuente de luz pulsada (lámpara de destello de xenón o láser pulsado, por ejemplo) y medir después del pulso de excitación. Esto da como resultado niveles de fondo de medición más bajos que en los ensayos de FI estándar. Las desventajas radican en que la instrumentación y los reactivos suelen ser más costosos, y en que las aplicaciones deben ser compatibles con el uso de estos colorantes de lantánidos tan específicos. El principal uso de TRF se encuentra en aplicaciones de cribado de fármacos, bajo una forma denominada TR-FRET (transferencia de energía de fluorescencia resuelta en el tiempo). Los ensayos TR- FRET son muy robustos (sensibilidad limitada a varios tipos de interferencia) y se miniaturizan fácilmente. La robustez, la capacidad de automatización y la miniaturización son características muy atractivas en un laboratorio de cribado.

La medición de la polarización de fluorescencia es muy similar a la detección por fluorescencia inducida (FI). La diferencia radica en que el sistema óptico incluye filtros polarizadores en la trayectoria de la luz: las muestras en la microplaca se excitan con luz polarizada (en lugar de luz no polarizada, como en los modos FI y TRF). Dependiendo de la movilidad de las moléculas fluorescentes presentes en los pocillos, la luz emitida estará polarizada o no. Por ejemplo, las moléculas grandes (como las proteínas) en solución, que rotan relativamente despacio debido a su tamaño, emitirán luz polarizada al ser excitadas con luz polarizada. Por otro lado, la rápida rotación de las moléculas más pequeñas provocará una despolarización de la señal. El sistema de emisión del lector de placas utiliza filtros polarizadores para analizar la polaridad de la luz emitida. Un nivel bajo de polarización indica que las moléculas fluorescentes pequeñas se mueven libremente en la muestra. Un nivel alto de polarización indica que la fluorescencia está unida a un complejo molecular mayor. Como resultado, una de las aplicaciones básicas de la detección por fluorescencia es en los ensayos de unión molecular, ya que permiten detectar si una pequeña molécula fluorescente se une (o no) a una molécula más grande no fluorescente: la unión produce una menor velocidad de rotación de la molécula fluorescente y un aumento en la polarización de la señal.

La dispersión de luz y la nefelometría son métodos para determinar la turbidez de una solución (es decir, la presencia de partículas insolubles). Un haz de luz atraviesa la muestra y las partículas en suspensión dispersan la luz. La luz dispersada hacia adelante que se mide indica la cantidad de partículas insolubles presentes en la solución. Las aplicaciones comunes de la nefelometría y la dispersión de luz incluyen el cribado automatizado de alta resolución (HTS) de la solubilidad de fármacos, la cinética de crecimiento microbiano a largo plazo, la floculación, la agregación y el monitoreo de la polimerización y la precipitación, incluida la inmunoprecipitación.