Hispanopedia WikiUn micrótomo (del griego mikros , que significa "pequeño", y temnein , que significa "cortar") es una herramienta de corte que se utiliza para producir láminas extremadamente finas de material, conocidas como secciones , proceso que se denomina microsección . Importantes en ciencia , los micrótomos se utilizan en microscopía para la preparación de muestras para su observación mediante luz transmitida o radiación electrónica .
Los micrótomos utilizan cuchillas de acero , vidrio o diamante , según la muestra que se vaya a cortar y el grosor deseado de las secciones. Las cuchillas de acero se utilizan para preparar secciones histológicas de tejidos animales o vegetales para microscopía óptica . Las cuchillas de vidrio se utilizan para cortar secciones para microscopía óptica y secciones muy finas para microscopía electrónica . Las cuchillas de diamante de grado industrial se utilizan para cortar materiales duros como huesos , dientes y materia vegetal resistente, tanto para microscopía óptica como electrónica. Las cuchillas de diamante de calidad gema también se utilizan para cortar secciones finas para microscopía electrónica.
La microtomía es un método para la preparación de secciones delgadas de materiales como huesos, minerales y dientes, y una alternativa al electropulido y al fresado iónico . Las secciones obtenidas con micrótomo pueden ser lo suficientemente delgadas como para seccionar un cabello humano a lo ancho, con un grosor de sección de entre 50 nm y 100 μm .
Historia
En los inicios del desarrollo del microscopio óptico , las secciones de plantas y animales se preparaban manualmente con cuchillas de afeitar. Se descubrió que, para observar la estructura de la muestra, era importante realizar cortes limpios y reproducibles de aproximadamente 100 μm, a través de los cuales la luz pudiera transmitirse. Esto permitió la observación de muestras mediante microscopios ópticos en modo de transmisión.
Uno de los primeros dispositivos para la preparación de tales cortes fue inventado en 1770 por George Adams, Jr. (1750–1795) y desarrollado posteriormente por Alexander Cummings . [ 2 ] El dispositivo era operado manualmente, y la muestra se sostenía en un cilindro y las secciones se creaban desde la parte superior de la muestra mediante una manivela. [ 1 ] [ 3 ]
En 1835, Andrew Prichard desarrolló un modelo basado en una mesa que permitía aislar la vibración al fijar el dispositivo a la mesa, separando al operador del cuchillo. [ 4 ]
En ocasiones, se atribuye la invención del micrótomo al anatomista Wilhelm His, Sr. (1865). [ 5 ] [ 6 ] En su Beschreibung eines Mikrotoms ( Descripción de un micrótomo en alemán ), Wilhelm escribió:
El aparato me ha permitido alcanzar una precisión en el trabajo que me permite obtener secciones que a mano me sería imposible crear. En concreto, me ha brindado la posibilidad de obtener secciones continuas de objetos durante la investigación.
Otras fuentes atribuyen además el desarrollo al fisiólogo checo Jan Evangelista Purkyně . [ 7 ] Varias fuentes describen el modelo de Purkyne como el primero en uso práctico. [ 8 ] [ 9 ]
Las incógnitas sobre los orígenes del micrótomo se deben a que los primeros micrótomos eran simplemente aparatos de corte, y la fase de desarrollo de los primeros dispositivos está en gran medida sin documentar.
A finales del siglo XIX, el desarrollo de muestras muy finas y uniformemente delgadas mediante microtomía, junto con la tinción selectiva de componentes o moléculas celulares importantes, permitió la visualización de detalles microscópicos. [ 10 ] [ 11 ]
Actualmente, la mayoría de los micrótomos son de diseño con bloque de cuchillas, cuchilla intercambiable, soporte para la muestra y mecanismo de avance. En la mayoría de los dispositivos, el corte de la muestra comienza al desplazarla sobre la cuchilla, donde el mecanismo de avance se mueve automáticamente hacia adelante para realizar el siguiente corte con el grosor seleccionado. El grosor de la sección se controla mediante un mecanismo de ajuste, lo que permite un control preciso.
Aplicaciones
Las aplicaciones más comunes de los micrótomos son:
- Técnica histológica tradicional : los tejidos se fijan, deshidratan, aclaran e incluyen en parafina fundida , que al enfriarse forma un bloque sólido. A continuación, el tejido se corta con un micrótomo en secciones de entre 2 y 50 μm de espesor. Posteriormente, el tejido se monta en un portaobjetos, se tiñe con el colorante acuoso adecuado tras retirar la parafina y se examina con un microscopio óptico. [ 12 ]
- Procedimiento de sección congelada : los tejidos ricos en agua se endurecen mediante congelación y se cortan en estado congelado con un micrótomo de congelación o un criostato de micrótomo ; las secciones se tiñen y se examinan con un microscopio óptico. Esta técnica es mucho más rápida que la histología tradicional (5 minutos frente a 16 horas) y se utiliza junto con procedimientos médicos para lograr un diagnóstico rápido. Las criosecciones también se pueden utilizar en inmunohistoquímica , ya que la congelación del tejido detiene la degradación más rápidamente que el uso de un fijador y no altera ni enmascara tanto su composición química.
- Técnica de microscopía electrónica : tras la inclusión de los tejidos en resina epoxi, se utiliza un micrótomo equipado con una cuchilla de vidrio o de diamante de grado gema para cortar secciones muy finas (normalmente de 60 a 100 nanómetros). Las secciones se tiñen con una solución acuosa de una sal de metal pesado apropiada y se examinan con un microscopio electrónico de transmisión . Este instrumento se denomina a menudo ultramicrótomo . El ultramicrótomo también se utiliza con su cuchilla de vidrio o una cuchilla de diamante de grado industrial para cortar secciones de exploración antes del corte fino. Estas secciones de exploración suelen tener un grosor de 0,5 a 1 μm y se montan en un portaobjetos de vidrio y se tiñen para localizar áreas de interés bajo un microscopio óptico antes del corte fino para el TEM. El corte fino para el TEM se realiza a menudo con una cuchilla de diamante de calidad gema. Como complemento a las técnicas tradicionales de TEM, los ultramicrótomos se encuentran cada vez más montados dentro de una cámara de SEM para que la superficie de la cara del bloque pueda ser fotografiada y luego retirada con el micrótomo para descubrir la siguiente superficie para su observación. Esta técnica se denomina microscopía electrónica de barrido de cara de bloque en serie (SBFSEM).
- Técnica de microtomía botánica: para materiales duros como madera, hueso y cuero, se requiere un micrótomo de trineo . Estos micrótomos tienen cuchillas más pesadas y no pueden cortar tan fino como un micrótomo convencional.
- Técnica de espectroscopia (especialmente espectroscopia FTIR o infrarroja ): se requieren secciones delgadas de polímero para que el haz infrarrojo pueda penetrar la muestra. Normalmente, las muestras se cortan con un espesor de entre 20 y 100 μm. Para un análisis más detallado de áreas mucho más pequeñas en una sección delgada, se puede utilizar la microscopía FTIR para la inspección de la muestra.
- Fabricación de dispositivos nanofluídicos: Recientemente se utilizó la ultramicrotomía para fabricar canales nanofluídicos para aplicaciones de biodetección. [ 13 ] [ 14 ] . Este método preciso y sencillo permitió la producción sostenible de varios cientos de nanohendiduras 2D basadas en disulfuro de molibdeno (MoS2) con dimensiones transversales idénticas y longitudes ajustables a partir de cristales en capas. Esto también permitió calcular una constante para la desviación de la ley empírica de Hooge y se utilizó para la aplicación de detección de ADN.
Un avance reciente es el micrótomo láser , que corta la muestra con un láser de femtosegundos en lugar de un bisturí mecánico. Este método es sin contacto y no requiere técnicas de preparación de la muestra. El micrótomo láser permite cortar prácticamente cualquier tejido en su estado natural. Dependiendo del material que se procese, se pueden obtener cortes de entre 10 y 100 μm de espesor.
Los intervalos de seccionamiento se pueden clasificar principalmente en:
- Seccionamiento seriado: obtención de una tira continua de secciones a partir de un bloque de parafina y utilización de todas ellas para la preparación de portaobjetos.
- Secciones escalonadas: recogidas a profundidades específicas en el bloque.
Rebanadas de riñón cortadas con precisión
Las secciones de riñón cortadas con precisión se refieren a secciones delgadas de tejido renal que se preparan con un micrótomo para estudiar las funciones renales, el metabolismo de los fármacos o los procesos patológicos. Los investigadores utilizan estas secciones para estudiar el impacto de las sustancias en la función renal. [ 15 ] [ 16 ] Esto incluye el metabolismo de los fármacos [ 17 ] [ 18 ] y los efectos de las sustancias tóxicas. [ 19 ]
Tipos
Trineo
Un micrótomo de deslizamiento es un dispositivo donde la muestra se coloca en un soporte fijo (lanzadera), que luego se mueve hacia adelante y hacia atrás sobre una cuchilla. Los micrótomos de deslizamiento modernos tienen el deslizador colocado sobre un cojinete lineal, un diseño que permite al micrótomo cortar fácilmente muchas secciones gruesas. [ 20 ] Al ajustar los ángulos entre la muestra y la cuchilla del micrótomo, se puede reducir la presión aplicada a la muestra durante el corte. [ 20 ] Las aplicaciones típicas para este diseño de micrótomo son la preparación de muestras grandes, como las incluidas en parafina para preparaciones biológicas. El espesor de corte típico que se puede lograr con un micrótomo de deslizamiento es de entre 1 y 60 μm.
Giratorio
Este instrumento es un micrótomo de diseño común. Este dispositivo funciona con un movimiento rotatorio secuencial, de modo que el corte propiamente dicho forma parte del movimiento rotatorio. En un micrótomo rotatorio, la cuchilla suele estar fija en posición vertical [ 21 ] , y el bloque de tejido sube y baja a través de la cuchilla, cortándolo en secciones finas.
En la figura de la izquierda se explica el principio del corte. Mediante el movimiento del portamuestras, la muestra se corta desde la posición 1 hasta la posición 2, momento en el que la sección recién cortada permanece sobre la cuchilla. En el punto más alto del movimiento de rotación, el portamuestras avanza el mismo grosor que la sección que se va a cortar, lo que permite realizar la siguiente sección.
En muchos micrótomos, el volante de inercia se puede accionar manualmente. Esto permite obtener un corte limpio, ya que la masa relativamente grande del volante evita que la muestra se detenga durante el proceso. En los modelos más recientes, el volante suele estar integrado en la carcasa del micrótomo. El grosor de corte típico para un micrótomo rotatorio oscila entre 1 y 60 μm. Para materiales duros, como una muestra incrustada en resina sintética, este diseño de micrótomo permite obtener secciones semifinas de tan solo 0,5 μm de grosor.
Criomicrotomo
Para el corte de muestras congeladas, muchos micrótomos rotatorios pueden adaptarse para cortar en una cámara de nitrógeno líquido, en una configuración denominada criomicrotomo. La temperatura reducida permite aumentar la dureza de la muestra, por ejemplo, mediante una transición vítrea, lo que posibilita la preparación de muestras semifinas. [ 20 ] Sin embargo, es necesario controlar la temperatura de la muestra y la de la cuchilla para optimizar el espesor resultante de la muestra.
Ultramicrótomo
El ultramicrótomo es una herramienta fundamental en la ultramicrotomía . Permite la preparación de secciones extremadamente delgadas, funcionando de manera similar a un micrótomo rotacional, pero con tolerancias mecánicas muy estrictas. Gracias a esta cuidadosa construcción mecánica, la dilatación térmica lineal del soporte se utiliza para lograr un control muy preciso del espesor. [ 20 ]
Estos cortes extremadamente finos son importantes para su uso con microscopio electrónico de transmisión (TEM) y microscopía electrónica de barrido de superficie de bloque en serie (SBFSEM), y a veces también son importantes para microscopía óptica. [ 21 ] El grosor típico de estos cortes está entre 40 y 100 nm para microscopía electrónica de transmisión y a menudo entre 30 y 50 nm para SBFSEM. También se toman secciones más gruesas, de hasta 500 nm de espesor, para aplicaciones especializadas de TEM o para secciones de exploración de microscopía óptica para seleccionar un área para las secciones delgadas finales. Se utilizan cuchillas de diamante (preferiblemente) y cuchillas de vidrio con ultramicrótomos. Para recoger las secciones, se hacen flotar sobre un líquido a medida que se cortan y se recogen cuidadosamente sobre rejillas adecuadas para la visualización de muestras en TEM. El grosor de la sección se puede estimar mediante los colores de interferencia de película delgada de la luz reflejada que se observan como resultado del grosor extremadamente bajo de la muestra. [ 22 ]
Vibrante
El micrótomo vibratorio funciona cortando con una cuchilla vibratoria, lo que permite realizar el corte con menos presión que la que requeriría una cuchilla fija. El micrótomo vibratorio se suele utilizar para muestras biológicas difíciles. [ 20 ] El grosor del corte suele ser de entre 30 y 500 μm para tejido vivo y de entre 10 y 500 μm para tejido fijado. [ 23 ]
Sierra
El micrótomo de sierra está especialmente diseñado para materiales duros como dientes o huesos. Este tipo de micrótomo cuenta con una sierra giratoria empotrada que corta la muestra. El espesor mínimo de corte es de aproximadamente 30 μm y permite realizar cortes en muestras relativamente grandes. [ 20 ]
Láser
El micrótomo láser es un instrumento para el corte sin contacto. [ 24 ] No se requiere preparación previa de la muestra mediante inclusión, congelación o fijación química , lo que minimiza los artefactos derivados de los métodos de preparación. Este diseño de micrótomo también puede utilizarse para materiales muy duros, como huesos o dientes, así como para algunas cerámicas. Dependiendo de las propiedades del material de la muestra, el espesor alcanzable oscila entre 10 y 100 μm.
El dispositivo funciona mediante un láser infrarrojo que actúa como herramienta de corte. Dado que el láser emite radiación en el infrarrojo cercano, en este rango de longitud de onda puede interactuar con materiales biológicos. Mediante un enfoque preciso de la sonda dentro de la muestra, se logra un punto focal de muy alta intensidad, de hasta TW /cm² . A través de la interacción no lineal de la penetración óptica en la región focal, se produce una separación del material en un proceso conocido como fotodisrupción. Al limitar la duración de los pulsos láser al rango de los femtosegundos, se controla con precisión la energía aplicada en la región objetivo, limitando así la zona de interacción del corte a menos de un micrómetro. Fuera de esta zona, el tiempo de aplicación ultracorto del haz produce un daño térmico mínimo o nulo en el resto de la muestra.
La radiación láser se dirige a un sistema óptico de escaneo rápido basado en espejos, lo que permite el posicionamiento tridimensional del punto de cruce del haz y su recorrido hasta la región de interés deseada. La combinación de alta potencia y alta velocidad de barrido permite al escáner cortar grandes áreas de la muestra en poco tiempo. En el micrótomo láser también es posible la microdisección láser de áreas internas en tejidos, estructuras celulares y otros tipos de estructuras pequeñas.
Cuchillos
La selección del perfil de la cuchilla del micrótomo depende del material y la preparación de las muestras, así como de los requisitos finales de la muestra (por ejemplo, el grosor y la calidad del corte).
Tipos de diseño y corte
En general, los cuchillos se caracterizan por el perfil de la hoja, que se clasifica en diseños planos cóncavos, en forma de cuña o en forma de cincel.
Las cuchillas de micrótomo cóncavas planas son extremadamente afiladas, pero también muy delicadas, por lo que solo se utilizan con muestras muy blandas. [ 21 ] Las cuchillas de perfil en cuña son algo más estables y se utilizan en materiales moderadamente duros, como en el corte de muestras de epoxi o criogénicas. Finalmente, el perfil de cincel, con su borde romo, aumenta la estabilidad de la cuchilla, aunque requiere mucha más fuerza para realizar el corte.
Para los ultramicrótomos, se requieren cuchillas de vidrio y diamante; por lo tanto, el ancho de corte de la cuchilla es del orden de unos pocos milímetros y, en consecuencia, es significativamente menor que el de las cuchillas de micrótomo clásicas. Las cuchillas de vidrio generalmente se fabrican mediante la fractura de barras de vidrio utilizando dispositivos especiales de fractura llamados "fabricantes de cuchillas". Las cuchillas de vidrio pueden usarse para la preparación inicial de muestras, incluso cuando las cuchillas de diamante se utilizan para el seccionamiento final. Las cuchillas de vidrio generalmente tienen pequeñas ranuras, hechas con cinta de plástico, que se llenan con agua para permitir que la muestra flote para su posterior recolección. [ 20 ] Las cuchillas de diamante pueden integrarse en una ranura existente de este tipo, lo que permite el mismo método de recolección.
Seccionamiento
Antes de cortarlas con un micrótomo, las muestras biológicas suelen colocarse en un fijador más rígido, en un proceso conocido como inclusión. Esto se logra mediante la entrada de una sustancia líquida alrededor de la muestra, como parafina (cera) o resina epoxi, que se coloca en un molde y posteriormente se endurece para producir un bloque que se puede cortar fácilmente.
La declinación es el ángulo de contacto entre la vertical de la muestra y la hoja del cuchillo. Si la hoja está perpendicular (declinación = 90°), el corte se realiza directamente mediante presión, por lo que las fuerzas son proporcionalmente mayores. Sin embargo, si el cuchillo está inclinado, su movimiento relativo se vuelve cada vez más paralelo al de la muestra, lo que permite un corte más profundo. Este comportamiento es crucial para muestras grandes o duras.
La inclinación de la cuchilla es el ángulo entre la hoja y la muestra. Para obtener un resultado óptimo, este ángulo debe elegirse adecuadamente. El ángulo óptimo depende de la geometría de la cuchilla, la velocidad de corte y muchos otros parámetros. Si el ángulo se ajusta a cero, el corte puede volverse irregular, y será necesario cambiar la posición de la cuchilla para corregirlo.
Si el ángulo es demasiado grande, la muestra puede arrugarse y el cuchillo puede provocar variaciones periódicas en el grosor del corte. Si se aumenta aún más el ángulo hasta un punto excesivo, se puede dañar la propia hoja del cuchillo.
Tecnología actual del micrótomo
El mercado de micrótomos [ 25 ] está experimentando una transformación significativa debido a los rápidos avances en la automatización de laboratorios y la ingeniería de precisión. Los laboratorios modernos están adoptando sistemas de micrótomos avanzados, como micrótomos rotatorios, micrótomos criostáticos y ultramicrótomos, para mejorar la preparación de muestras de tejido.
Véase también
Referencias
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Enlaces externos
- . Encyclopædia Britannica (11.ª ed.). 1911.
- Histología
- Herramientas forestales
- Máquinas de corte
