Método de Miles y Misra

El método de Miles y Misra (o recuento de células viables en superficie) es una técnica utilizada en microbiología para determinar el número de unidades formadoras de colonias en una suspensión bacteriana u homogeneizado . La técnica fue descrita por primera vez en 1938 por Miles, Misra e Irwin, quienes en ese momento trabajaban en la LSHTM . ^{[ 1 ]} Se ha demostrado que el método de Miles y Misra es preciso. ^{[ 2 ]}

Materiales

• Una pipeta dosificadora calibrada o una pipeta automática que dispensa gotas de 20 μl.
• Placas de Petri que contengan agar nutritivo u otro medio de cultivo adecuado.
• Solución salina tamponada con fosfato (PBS) u otro diluyente apropiado.
• Suspensión bacteriana u homogeneizado.

Método

• El inóculo/suspensión se diluye en serie añadiendo 1x de suspensión a 9x de diluyente. Cuando se desconoce la cantidad de bacterias, las diluciones deben hacerse al menos a 10 ⁻⁸ .
• Se necesitan tres placas para cada serie de diluciones; por razones estadísticas, se requiere un promedio de al menos 3 recuentos.
• La superficie de las placas debe estar lo suficientemente seca para permitir que una gota de 20 μl se absorba en 15-20 minutos.
• Las placas están divididas en sectores iguales (es posible utilizar hasta 8 por placa). Los sectores están etiquetados con las diluciones.
• En cada sector, se depositan 20 μl de la dilución adecuada sobre la superficie del agar y se deja que la gota se extienda de forma natural. En la descripción original del método, una gota depositada desde una altura de 2,5  cm se extiende sobre un área de 1,5-2,0  cm. Es importante evitar tocar la superficie del agar con la pipeta.
• Las placas se dejan en posición vertical sobre la mesa para que se sequen antes de invertirlas e incubarlas a 37  °C durante 18-24 horas (o en las condiciones de incubación adecuadas según el microorganismo y el agar utilizados).
• Se observa el crecimiento en cada sector; las altas concentraciones darán lugar a un crecimiento confluente en toda la superficie de la gota, o a un gran número de colonias pequeñas o fusionadas. Las colonias se cuentan en el sector donde se observa el mayor número de colonias discretas de tamaño completo (normalmente se cuentan los sectores que contienen entre 2 y 20 colonias).
• La siguiente ecuación se utiliza para calcular el número de unidades formadoras de colonias (UFC) por ml a partir de la alícuota/muestra original:

UFC por ml = (Número promedio de colonias para una dilución / 0,02) x factor de dilución .

Ventajas

• Más rápido que otros métodos.
• Reduce la contaminación bacteriana de la superficie de trabajo.

• Unidad formadora de colonias