Mitoplast

Un mitoplasto es una mitocondria a la que se le ha quitado la membrana externa, dejando intactas la membrana interna y la matriz . ^{[ 1 ]}

Para comenzar el proceso, primero se deben separar las mitocondrias de las células cultivadas . Este proceso suele constar de dos pasos: homogeneización para liberar el contenido intercelular y centrifugación diferencial para separar las mitocondrias de otros orgánulos . Una vez aisladas las mitocondrias, se pueden formar los mitoplastos. Los mitoplastos se forman comúnmente utilizando un aparato llamado prensa francesa . Al pasar las mitocondrias por la estrecha válvula de la prensa francesa, experimentan presiones extremadamente altas, de alrededor de 2000 psi, que rompen la membrana mitocondrial externa. Los mitoplastos se sedimentan y se conservan en una solución tampón específica hasta su uso. Cuando se necesitan, simplemente se colocan en una solución tampón de incubación de cloruro de potasio (KCl), lo que provoca la hinchazón de la matriz mitocondrial. Como resultado de esta hinchazón, la membrana interna sobresale de la membrana externa, formando una de dos formas distintas. ^{[ 2 ]} Los mitoplastos generados con el método de prensa francesa suelen producir una vesícula bilobulada y tienen una forma similar a un ocho. ^{[ 3 ]} Estos mitoplastos con forma de ocho son los preferidos porque se consideran los más sanos. Sin embargo, también pueden formarse mitoplastos con forma de O, pero este tipo no es el preferido para uso experimental, ya que a menudo están dañados.

El conocimiento científico sobre las mitocondrias ha avanzado enormemente desde la década de 1930 gracias al desarrollo del microscopio electrónico . A principios de la década de 1950, los científicos lograron establecer que las mitocondrias poseen dos membranas distintas. Sin embargo, dado que la investigación mitocondrial se centraba principalmente en la cadena de transporte de electrones y la fosforilación oxidativa , no fue hasta más de una década después que se desarrollaron métodos para separar las dos membranas mitocondriales.

Durante mediados y finales de la década de 1960, varios laboratorios independientes afirmaron haber separado con éxito la membrana mitocondrial externa e interna. En marzo de 1967, un equipo de investigadores del Laboratorio de Fisiología Nutricional en Francia publicó un artículo que analizaba sus estudios sobre las actividades enzimáticas de la membrana mitocondrial externa. Dado que sus estudios requerían el aislamiento de la membrana mitocondrial externa, también se describió un método basado en las acciones sucesivas de digitonina y sonicación para separar las dos membranas mitocondriales. Para completar su procedimiento de aislamiento, la fracción bruta de la membrana externa se purificó mediante centrifugación diferencial. ^{[ 4 ]} Aproximadamente un año después, en julio de 1968, un equipo de investigación del Departamento de Química Fisiológica de la Facultad de Medicina Johns Hopkins publicó un artículo que describía su método para la separación de las membranas mitocondriales en hígados de rata, también utilizando digitonina y centrifugación diferencial. Además de separar las membranas externa e interna, lograron separar aún más la membrana interna y la matriz mediante un tratamiento con un detergente no iónico llamado Lubrol. Este proceso permitió calcular el contenido proteico relativo dentro de cada componente mitocondrial. ^{[ 5 ]} La justificación en ambos artículos para usar bajas concentraciones de digitonina para separar la membrana mitocondrial externa fue que esta era rica en colesterol, lo que provocaría su unión a la digitonina. Después de un estudio más profundo, el equipo de investigación de Johns Hopkins logró perfeccionar su método de preparación de mitoplastos para producir mitocondrias sin membrana externa y con una membrana interna y matriz relativamente intactas.

Otro procedimiento para la preparación de mitoplastos, descrito por dos grupos de investigación adicionales, aprovechó la contracción selectiva de la membrana interna después de que las mitocondrias hepáticas se expusieran a un ciclo de hinchamiento-contracción. Durante este procedimiento, la membrana externa hinchada se rompió espontáneamente o, idealmente, después de ser sometida a una sonicación suave. Tras la ruptura de la membrana externa, los componentes de la membrana interna pudieron separarse de la membrana externa mediante centrifugación diferencial. ^{[ 6 ]} Este procedimiento es eficaz debido a las marcadas diferencias entre las membranas mitocondriales externa e interna, específicamente en lo que respecta al comportamiento osmótico y la permeabilidad. Según una extensa investigación, la membrana interna es capaz de responder a los cambios en la presión osmótica desplegándose y replegándose. Sin embargo, la membrana externa no ha mostrado respuestas reversibles a los cambios en la presión osmótica. Por lo tanto, la distensión y ruptura de la membrana externa es un proceso pasivo causado por el despliegue de la membrana interna debido al cambio en la presión osmótica.

Si bien estos métodos de separación demostraron ser bastante eficientes en su momento, su naturaleza mecánica quedó obsoleta a medida que se desarrollaron nuevas tecnologías, como la prensa francesa, que facilitaron y agilizaron la creación de mitoplastos para los investigadores.

La capacidad de los investigadores para separar las dos membranas mitocondriales y formar mitoplastos ha abierto un sinfín de nuevas posibilidades para el estudio de las mitocondrias. Como se mencionó anteriormente, ahora es posible calcular el contenido proteico relativo en cada componente mitocondrial. Además, los mitoplastos permitieron determinar la distribución intramitocondrial de las enzimas, algo que antes era imposible debido a que la membrana interna estaba rodeada por la externa. Por lo tanto, poco después de que se lograra crear mitoplastos con facilidad, se dispuso de diversos datos sobre casi todas las enzimas cuya presencia en las mitocondrias se sospechaba.

Los mitoplastos también son útiles para el análisis electrofisiológico de la función mitocondrial, ya que las mitocondrias pueden mantener su función normal incluso después de que se haya eliminado su membrana externa. Específicamente, la electrofisiología de patch-clamp ha surgido como un método novedoso para estudiar la funcionalidad de la membrana interna. ^{[ 7 ]} Este método facilita la medición sensible de la corriente a través de la membrana, útil para estudiar la cadena de transporte de electrones y la fuga de protones (es decir, el desacoplamiento del movimiento de protones a lo largo de su gradiente electroquímico y la síntesis de ATP a través de la ATP sintasa ).