Salida mitótica

La salida de la mitosis es un punto de transición importante que marca el final de la mitosis y el inicio de la fase G1 . La célula necesita mecanismos de control específicos para asegurar que, una vez que sale de la mitosis, no vuelva a entrar en ella hasta haber completado las fases G1, S y G2 y haber superado todos los puntos de control necesarios. Muchos factores, como las ciclinas , las quinasas dependientes de ciclinas (CDK), las ubiquitina ligasas , los inhibidores de las quinasas dependientes de ciclinas y las fosforilaciones reversibles, regulan la salida de la mitosis para garantizar que los eventos del ciclo celular se produzcan en el orden correcto con el menor número de errores. ^{[ 1 ]} El final de la mitosis se caracteriza por la ruptura del huso, el acortamiento de los microtúbulos del cinetocoro y el crecimiento pronunciado de los microtúbulos astrales (no cinetocóricos). En una célula eucariota normal, la salida de la mitosis es irreversible. ^{[ 2 ]}

Se hicieron muchas especulaciones con respecto a los mecanismos de control empleados por una célula para promover la irreversibilidad de la salida mitótica en un organismo modelo eucariota , la levadura de gemación Saccharomyces cerevisiae . La degradación proteolítica de los reguladores del ciclo celular y los efectos correspondientes en los niveles de quinasas dependientes de ciclinas se propusieron como un mecanismo que promueve el ciclo celular eucariota y la transición de metafase a anafase en particular. En esta teoría, el complejo promotor de la anafase (APC), una clase de ubiquitina ligasa, facilita la degradación de las ciclinas mitóticas (Clb2) y los factores inhibidores de la anafase (PDS1, CUT2) para promover la salida mitótica. ^{[ 3 ]} El APC ubiquitina el motivo de nueve aminoácidos conocido como caja de destrucción (caja D) en el dominio NH2-terminal de las ciclinas mitóticas para su degradación por el proteasoma . ^{[ 3 ]} APC en asociación con Cdc20 (APC-Cdc20) ubiquitina y dirige las ciclinas mitóticas (Clb2) para su degradación en la fase inicial. Simultáneamente, APC-Cdc20 media la degradación de las securinas , que inhiben las separasas mediante unión, al inicio de la anafase. La separasa liberada y activa escinde la cohesina que mantenía unidas las cromátidas hermanas , facilitando la separación de las cromátidas hermanas e iniciando la salida de la mitosis al promover la liberación de Cdc14 del nucléolo. ^{[ 4 ] [ 5 ]} En una fase posterior, la regulación negativa de Cdk1 y la activación de Cdc14, una fosfatasa activadora de Cdh1, promueve la formación de APC en asociación con Cdh1 (APC-Cdh1) para degradar Clb2s. ^{[ 2 ]} Cdc20 y Cdh1, que son los activadores de APC, reclutan sustratos como la securina y las ciclinas de tipo B (Clb) para la ubiquitinación. ^{[ 6 ]} Sin los complejos Cdk1-Clb2 para fosforilar proteínas que están involucradas en la dinámica del huso como Sli15, Ase1 y Ask1 , se promueve la elongación del huso y la segregación cromosómica, facilitando la salida de la mitosis. ^{[ 2 ]} La importancia de la degradación proteolítica en el ciclo celular eucariota cambió la visión de la división celular como una simple cascada de quinasas a un proceso más complejo en el que las interacciones entre fosforilación, ubiquitinación y proteólisis son necesarias. ^{[ 3 ]} Sin embargo, experimentos usando células de levadura en gemación con cdc28-as1, un alelo Cdk sensible a INM-PP1 (análogo de ATP) , demostraron que la destrucción de las ciclinas de tipo B (Clb) no es necesaria para desencadenar la salida irreversible de la mitosis. ^{[ 2 ]}La degradación de Clb2 acortó el período de inhibición de Cdk1 necesario para desencadenar la salida irreversible de la mitosis, lo que indica que la proteólisis de la ciclina contribuye a la naturaleza dinámica del ciclo celular eucariota debido a la menor duración de su acción, pero es improbable que sea el principal factor determinante en el desencadenamiento de transiciones irreversibles del ciclo celular. ^{[ 2 ]}

Se realizaron descubrimientos que indicaron la importancia del nivel de los inhibidores de las quinasas dependientes de ciclinas en la regulación del ciclo celular eucariota. En particular, se demostró que el nivel de Sic1 , un inhibidor estequiométrico de los complejos Clb-CDK en la levadura en gemación, es particularmente importante en la transición irreversible G1-S al activar irreversiblemente las quinasas de la fase S. ^{[ 7 ]} Se demostró que el nivel de Sic1 juega un papel importante en el desencadenamiento de la salida mitótica irreversible (transición M-G1) así como en la transición G1-S. Durante la mitosis, la disminución de los niveles de Cdk1 conduce a la activación de Cdc14, una fosfatasa que contrarresta a Cdk1 a través de la activación de Cdh1 y Swi5, un activador transcripcional de las proteínas Sic1. ^{[ 8 ]} Mientras que la degradación de Sic1 a un cierto nivel bajo desencadenó el inicio de la fase S, la acumulación de Sic1 a un cierto nivel alto fue necesaria para desencadenar la salida mitótica irreversible. ^{[ 2 ]} Los inhibidores de Cdk1 podrían inducir la salida de la mitosis incluso cuando la degradación de las ciclinas de tipo B estaba bloqueada por la expresión de Clbs no degradables o inhibidores del proteasoma. Sin embargo, las cromátidas hermanas no se segregaron y las células revirtieron a la mitosis una vez que se lavaron los inhibidores, lo que indica que se necesita alcanzar un nivel umbral de los inhibidores para desencadenar la salida irreversible de la mitosis independientemente de las degradaciones de las ciclinas. ^{[ 9 ]} A pesar de los diferentes umbrales del nivel de Sic1 que se requieren para desencadenar la salida de la mitosis en comparación con la transición G1-S, se demostró que el nivel de Sic1 juega un papel clave en la regulación del ciclo celular eucariota al inhibir la actividad de las CDK.

Debido a que el ciclo celular eucariota involucra una variedad de proteínas e interacciones reguladoras, se puede adoptar un enfoque de sistemas dinámicos para simplificar un circuito biológico complejo en un marco general para un mejor análisis. ^{[ 10 ] [ 11 ]} Entre las cuatro posibles relaciones de entrada/salida, la relación entre el nivel de Sic1 y la salida de la mitosis parece mostrar las características de un interruptor biestable irreversible, impulsado por la retroalimentación entre APC-Cdh1, Sic1 y Clb2-Cdk1. ^{[ 2 ]} Se sabe que la biestabilidad controla funciones biológicas como el control del ciclo celular y la diferenciación celular , y juega un papel clave en muchas redes reguladoras celulares. ^{[ 12 ]} La relación de entrada/salida biestable se caracteriza por dos estados estables con dos puntos de bifurcación. Son posibles múltiples salidas para una entrada específica en la región de biestabilidad, marcada por dos puntos de bifurcación. Además, la relación biestable muestra histéresis: el estado/salida final depende del historial de la entrada, así como del valor actual de la entrada porque el sistema tiene memoria. ^{[ 10 ]} Un punto de bifurcación tiene un valor de parámetro de control negativo (el punto de bifurcación está en el otro lado del eje), lo que resulta en la desconexión entre los dos estados estables y la irreversibilidad de la transición de un estado a otro. Con respecto a la salida de la mitosis, los dos estados estables están definidos por la mitosis y la fase G1. Una vez que el nivel de Sic1 (entrada) se acumula más allá del umbral, ocurre una transición irreversible de la mitosis (estado estable I) a la fase G1 (estado estable II). En el entorno imperfecto, la única bifurcación que permanece intacta es la bifurcación de silla-nodo . La bifurcación de silla-nodo no se rompe (la silla-nodo es el comportamiento genérico esperado), mientras que las bifurcaciones transcrítica y de horquilla se rompen en presencia de imperfecciones. ^{[ 13 ]} Por lo tanto, la única bifurcación unidimensional que puede existir en un mundo biológico imperfecto es la bifurcación de silla-nodo. ^{[ 10 ]} La relación biestable entre la transición M-G1 y el nivel Sic1 se puede representar como un diagrama de dos bifurcaciones de nodo de silla en las que el comportamiento del sistema cambia cualitativamente con un pequeño cambio en el parámetro de control, la cantidad de Sic1.

Debido a que el comportamiento del ciclo celular depende críticamente de la cantidad de Sic1 en el estado de transición M-G1, la cantidad de Sic1 está estrictamente regulada por retroalimentaciones a nivel de sistemas. Debido a que Cdk1-Clb2 inhibe a Sic1 fosforilándolo y haciéndolo disponible para la degradación a través de la ubiquitinación, la degradación de Cdk1-Clb2 dependiente de APC-Cdh1 no solo disminuye el nivel de complejos Cdk1-Clb2 disponibles sino que también aumenta el nivel de Sic1, lo que a su vez inhibe aún más la función de Cdk1-Clb2. ^{[ 8 ]} Esta activación del bucle de doble retroalimentación negativa se inicia a partir de la degradación de Cdk1-Clb2 dependiente de APC-Cdc20 y la liberación de Cdc14 de la proteína nucleolar Net1/Cfi1. ^{[ 14 ]} La vía FEAR (liberación temprana de anafase de Cdc14) facilita la fosforilación de Net1 dependiente de Clb2-Cdk1, lo que libera transitoriamente a Cdc14 de Net1. ^{[ 15 ]} Los complejos liberados de Cdc14 y Clb2-Cdk1 forman husos que activan la red de salida mitótica (MEN). MEN permite la liberación sostenida de Cdc14 del nucléolo, ^{[ 15 ]} y Cdc14 contrarresta la actividad de Clb2-Cdk1 activando Cdh1 y estabilizando Sic1 a través de la activación del activador transcripcional Swi5 de Sic1. ^{[ 16 ]} Sic1 se autorregula positivamente inhibiendo Cdk1-Clb2 para liberar la inhibición de Swi5, y Cdh1 también se autorregula positivamente inhibiendo Clb2-Cdk1 para liberar la inhibición de MEN, lo que puede activar Cdc14 y posteriormente a Cdh1 mismo. El bucle de retroalimentación doble negativa , formado por APC-Cdh1 y Sic1, es necesario para mantener baja la actividad de Clb2-Cdk1 porque Clb2 autoactiva su síntesis activando los factores de transcripción, el complejo Fkh2– Mcm1 Ndd1. ^{[ 8 ]}

El ciclo celular eucariota consta de varios puntos de control y bucles de retroalimentación para asegurar una división celular fiel y exitosa. Durante la mitosis, por ejemplo, cuando los cromosomas duplicados se unen incorrectamente al huso mitótico, las proteínas del punto de control del ensamblaje del huso (SAC), incluidas Mad y Bub, inhiben APC-Cdc20 para retrasar la entrada en la anafase y la degradación de las ciclinas de tipo B. Además, cuando los husos mitóticos están desalineados, MEN y posteriormente Cdc14 se inhiben de manera dependiente de Bub2 y Bfa1 para prevenir la degradación de las ciclinas mitóticas y la entrada en la anafase. ^{[ 16 ]} Sic1 es un buen ejemplo que demuestra cómo las retroalimentaciones a nivel de sistemas interactúan para detectar las condiciones ambientales y desencadenar transiciones del ciclo celular. Aunque la transición M-G1 real es enormemente compleja con numerosas proteínas y regulaciones involucradas, el enfoque de sistemas dinámicos permite simplificar este sistema complejo en una relación de entrada/salida biestable con dos bifurcaciones de nodo de silla en la que la salida (salida de la mitosis) depende de la concentración crítica de Sic1. Mediante análisis unidimensionales, podría ser posible explicar muchos de los puntos de transición irreversibles en el ciclo celular eucariota que están regidos por el control y la retroalimentación a nivel de sistemas. Otros ejemplos de puntos de transición irreversibles incluyen Start (compromiso irreversible con un nuevo ciclo de división celular), que puede explicarse mediante un interruptor biestable irreversible cuyo parámetro de control está estrictamente regulado por las retroalimentaciones sistémicas que involucran a Cln2, Whi5 y SBF. ^{[ 17 ]}

La regulación de la progresión y salida de la mitosis es de suma importancia, ya que los errores en este proceso pueden conducir a aneuploidía y cáncer. Estudios recientes, en particular aquellos que involucran el inhibidor de Cdk1 flavopiridol, han arrojado luz sobre el fascinante aspecto de la reversibilidad de la salida de la mitosis, desafiando las ideas arraigadas sobre la unidireccionalidad de las transiciones del ciclo celular. ^{[ 18 ]} Fundamental para comprender la salida de la mitosis es Cdk1, una quinasa que orquesta la progresión mitótica. Activada por la unión a ciclinas, particularmente ciclina A y B, la actividad de Cdk1 alcanza su máximo durante la mitosis. ^{[ 18 ]} La degradación oportuna de estas ciclinas, especialmente la ciclina B, es crucial para la salida de la mitosis. Esta degradación asegura la desfosforilación de los sustratos de Cdk1, actuando como un mecanismo de sincronización para la transición crítica de metafase a anafase y, finalmente, a la salida de la mitosis. Esta regulación meticulosa resalta el compromiso de la célula con la irreversibilidad de las fases del ciclo celular en condiciones normales. La introducción de flavopiridol, un potente inhibidor de Cdk1, ha revolucionado la comprensión de la regulación mitótica. Cuando se aplicó a células de vertebrados durante la mitosis, flavopiridol indujo una salida prematura de la mitosis, acompañada de citocinesis, pero notablemente sin separación previa de cromátidas. ^{[ 18 ]} Este fenómeno condujo a un intrigante fenotipo de "corte" donde los cromosomas, aunque descondensados ​​y envueltos en membranas nucleares recién formadas, permanecieron atrapados dentro del cuerpo medio de la célula (Figura 4). El hallazgo más sorprendente de los estudios con flavopiridol es la reversibilidad de la salida mitótica. Cuando se inhibe la actividad del proteasoma, responsable de la degradación de la ciclina, los efectos del flavopiridol se vuelven reversibles. ^{[ 18 ]} Tras la eliminación de flavopiridol, las células previamente inducidas a salir prematuramente de la mitosis pudieron revertir a un estado de metafase. Esta reversión implica el reensamblaje del huso mitótico, la retracción del surco citocinético, la disolución de la envoltura nuclear recién formada y la recondensación de los cromosomas. La reversibilidad de la salida mitótica depende en gran medida de la estabilidad de la ciclina B. ^{[ 18 ]} En condiciones donde la ciclina B está protegida de la degradación, como en presencia de inhibidores del proteasoma como MG132, la salida mitótica inducida por flavopiridol puede revertirse. ^{[ 18 ]} Este hallazgo fue corroborado además utilizando la ciclina B1 no degradable, que mostró que las células con ciclina B estabilizada podían revertir a metafase tras la eliminación de flavopiridol, lo que indica una correlación directa entre la estabilidad de la ciclina B y la reversibilidad de la salida mitótica. ^{[ 18 ]}

La investigación oncológica se ha centrado durante mucho tiempo en la interrupción de la división celular como estrategia terapéutica. Los fármacos antimitóticos, dirigidos a la dinámica de los microtúbulos, han sido una piedra angular de este enfoque. Sin embargo, su éxito a menudo se ve obstaculizado por efectos secundarios como la neurotoxicidad y una eficacia limitada contra tumores sólidos. ^{[ 19 ]} El uso de taxanos y alcaloides de la vinca, dirigidos a la dinámica de los microtúbulos, ha sido un estándar en la terapia oncológica. Sin embargo, su eficacia a menudo se ve comprometida por efectos secundarios graves, especialmente la neurotoxicidad , debido a la perturbación de los microtúbulos en las neuronas. Además, los fármacos antimitóticos específicos del huso, aunque menos neurotóxicos, han mostrado un éxito limitado contra tumores sólidos, a menudo comparable o inferior al de los fármacos tradicionales. ^{[ 19 ]} Este escenario subraya la necesidad de estrategias antimitóticas alternativas que sean a la vez más eficaces y menos tóxicas. Estudios recientes han cambiado el enfoque al proceso de salida de la mitosis, particularmente al bloqueo de esta fase como una nueva estrategia anticancerígena. El actor clave en este contexto es Cdc20, una proteína reguladora que activa el Complejo Promotor de la Anafase/Ciclosoma (APC/C), lo que conduce a la degradación de la ciclina B1 y la salida de la mitosis. La inhibición de Cdc20 mediante técnicas de ARN de interferencia induce una detención mitótica prolongada, lo que lleva a la muerte celular. ^{[ 19 ]} Se ha demostrado que este enfoque es más eficaz que los fármacos que alteran el huso mitótico para eliminar células cancerosas, incluidas aquellas resistentes a la apoptosis o propensas al deslizamiento (escape de la detención inducida por fármacos). ^{[ 19 ]} La inhibición de Cdc20 conduce a una detención mitótica sostenida al estabilizar los niveles de ciclina B1, previniendo así el deslizamiento. Esta detención prolongada da más tiempo para que los mecanismos apoptóticos se activen y eliminen las células cancerosas. A diferencia de los fármacos que alteran el huso mitótico, esta estrategia no depende de la activación del punto de control del ensamblaje del huso (SAC) y es eficaz incluso en células deficientes en SAC. ^{[ 19 ]} Además, la inhibición de Cdc20 induce la muerte celular a través de vías dependientes e independientes de la permeabilización de la membrana mitocondrial externa (MOMP), lo que la hace efectiva contra una gama más amplia de tipos de células cancerosas (Figura 5). ^{[ 19 ]}El bloqueo de la salida mitótica presenta varias ventajas sobre los fármacos tradicionales dirigidos al huso mitótico. En primer lugar, evita la neurotoxicidad asociada a la alteración de los microtúbulos. En segundo lugar, su eficacia no está limitada por la actividad del SAC ni por la capacidad de la célula para evadir la muerte mediante deslizamiento. Finalmente, actúa sobre una etapa fundamental y tardía de la división celular, lo que potencialmente reduce la probabilidad de desarrollo de resistencia en comparación con los fármacos que actúan sobre etapas anteriores, como el ensamblaje del huso. Si bien es prometedor, el uso de la salida mitótica como terapia contra el cáncer no está exento de desafíos. El desarrollo de inhibidores específicos y potentes de Cdc20 u otras proteínas de la salida mitótica es un obstáculo importante. ^{[ 19 ]} Además, comprender los mecanismos exactos por los que la detención mitótica prolongada induce la muerte celular e identificar posibles dianas farmacológicas dentro de estas vías sigue siendo un área clave de investigación.

En la levadura en gemación, el proceso de salida de la mitosis involucra una red de proteínas que entrelazan los conceptos de polaridad celular y regulación mitótica. En el centro de esta red se encuentran las funciones de Cdc14, una fosfatasa del ciclo celular, y varias proteínas de polaridad celular, que en conjunto aseguran la transición ordenada de la mitosis a la fase G1 del ciclo celular. ^{[ 20 ]} Cdc14 juega un papel fundamental en la salida de la mitosis al desfosforilar objetivos clave como Cdh1/Hct1 y Sic1. ^{[ 20 ]} Esta acción conduce a una disminución en la actividad de la quinasa dependiente de ciclina mitótica (Cdk-Clb), un requisito previo para la salida de la mitosis. La regulación de Cdc14 está estrictamente controlada; se encuentra secuestrada en el nucléolo durante la interfase y la metafase y se libera al inicio de la anafase. Esta liberación es crucial para que Cdc14 cumpla su función de desencadenar la salida de la mitosis. ^{[ 20 ]} La liberación de Cdc14 del nucléolo implica dos pasos esenciales: una liberación parcial inicial facilitada por la separasa (Esp1) y la polo quinasa (Cdc5) y una liberación completa posterior gobernada por la red de salida mitótica (MEN). ^{[ 20 ]} La MEN es una red de señalización impulsada por GTPasa crucial para la salida mitótica, y su correcto funcionamiento es esencial para la fidelidad del ciclo celular. ^{[ 20 ]} Un actor clave en la MEN es Tem1, una pequeña GTPasa similar a Ras. La regulación de Tem1 es compleja, e implica su inactivación por el complejo GAP Bfa1-Bub2 y su activación por el GEF Lte1. ^{[ 20 ]} La dinámica espacial de estas interacciones es crucial; mientras que Tem1 está asociada con el cuerpo polar del huso (SPB), Lte1 está asociada con la corteza de la yema pero no con la célula madre. Esta disposición asegura que la activación de la MEN y, en consecuencia, la salida mitótica ocurran solo cuando el núcleo está correctamente posicionado dentro de la yema. Las proteínas Cdc24, Cdc42 y Ste20, a través de su interacción con Lte1 y otros componentes de MEN, desempeñan un papel vital para asegurar que la salida de la mitosis esté estrictamente regulada y ocurra solo bajo las condiciones adecuadas (Figura 6). ^{[ 20 ]} Por ejemplo, la proteína de polaridad celular Cdc42 regula la actividad de Ste20, lo que resalta la interconexión de estas vías. ^{[ 20 ]}